鄭將臣，萬全，程起群，趙金良

(1.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業(yè)部海洋與河口漁業(yè)資源及生態(tài)重點開放實驗室，上海200090;2.安徽農業(yè)大學動物科技學院，安徽合肥230036;3.上海海洋大學農業(yè)部水產種質資源與利用重點開放實驗室，上海201306)

全世界現有龜鱉類動物約14科、324種［1］。目前，國外關于龜鱉目分子系統(tǒng)學的研究較多［2－10］，國內對這方面的研究相對較少，且大多數是基于龜鱉類線粒體的研究［11－15］，而用核基因來分析龜鱉類系統(tǒng)進化的研究鮮見報道。RAG2是重組激活基因 (Recombination activatinggenes，RAGs)的一種。RAGs在脊椎動物中普遍存在，在進化過程中非常保守，不同物種之間其堿基組成變化很少，近年來被較多地運用于物種進化和親緣關系的分析［16－20］。RNA 指紋蛋白 35(RNA fingerprint protein 35，R35)也是一種核內基因，目前關于這個蛋白的功能尚不明確，但是RNA指紋蛋白35基因被認為是單拷貝基因［21］，因此，國外已有若干學者運用RNA指紋蛋白35基因作為標記來研究龜鱉類動物的系統(tǒng)進化［7，22］。

本研究中，作者測定了兩種龜的R35內含子序列和6種龜的RAG2部分序列，并結合NCBI上其它龜鱉類的相關序列，以此來初步探討龜鱉類的系統(tǒng)進化特征。

1 材料與方法

1.1 材料

在安徽省長江水生動物保護中心采集6種龜的樣品，每種龜各取1只個體的肌肉組織保存于冰箱(－20℃)中備用。龜鱉類分類地位均依據國際龜類動物分類工作組2009年修訂的最新分類系統(tǒng)［1］。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取、PCR擴增和測序 基因組DNA采用標準的酚/氯仿法提取［23］，略作修改。R35基因擴增采用引物R35EX1和R35EX2［22］，序列分別為

RAG2基因擴增采用引物 F2(RAG2)和 R2－1(RAG2)［24］，序列分別為

PCR反應在50 μL體系中進行，包括10×PCR Buffer(Mg2+Plus)5 μL，dNTP Mixture(各 2.5 mmol/L)2 μL，引物 (10 μmol/L)各 2 μL，Taq酶2.5 U，模板DNA 40 ng。反應條件為:94℃下預變性5 min;94℃下變性45 s，退火 (R35和RAG2分別為58℃和51℃)45 s，72℃下延伸60 s，共進行40個循環(huán);最后于72℃下再延伸7 min。PCR產物經割膠純化后在ABI3730型DNA測序儀上雙向測序。

1.2.2 數據分析 對所測得的序列進行拼接，再用 Clustal X 1.83［25］、DnaSP［26］、MEGA 4.1［27］等軟件對所有序列進行比對，計算其多態(tài)位點數、簡約信息位點數、堿基組成和轉換/顛換比率等遺傳信息指數，并基于Kimura雙參數模型 (Kimura－2－parameter，K－2－P)［28］計算種、屬、科間的遺傳距離。為了進一步全面研究龜鱉類的系統(tǒng)發(fā)生關系，從NCBI下載龜鱉類的R35和RAG2序列 (表1)一并分析。

分別對R35和RAG2序列進行系統(tǒng)進化分析，再將二者合并進行分析。采用PAUP4.0bl0軟件中的PHT(partition homogeneity test)方法對R35和RAG2序列的數據進行同質性檢驗［29］。

為了判斷這些序列是否適合系統(tǒng)進化分析，用兩種方法對序列的飽和度進行檢測。一種是基于轉換和顛換與K－2－P的作圖分析［28］;另一種是運用指數 Iss檢測［30］。兩種檢測均在 DAMBE 軟件［31］上進行。

采用鄰接法 (Neighbor－joining，NJ)、最大簡約法 (Maximum－parsimony，MP)和最大似然法(Maximum likelihood，ML)構建分子系統(tǒng)樹。NJ樹用MEGA軟件構建，遺傳距離模型選擇Kimura雙參數模型，將序列中的轉換和顛換位點均視為信息位點并對所有位點一致性加權，對于序列中的插入/缺失位點則采用成對刪除。MP樹在PAUP4.0bl0軟件［32］上進行，選擇簡約標準 (Parsimony criterion)、啟發(fā)式搜尋 (Heuristic search)、樹二分再連接 (Tree bisection reconnection，TBR)、逐步加入法隨機加入序列 (10000 random stepwise addition sequence replicates)，所有數據均未加權。當幾個相同的簡約樹出現時，最后結果將由嚴格一致樹來表示。在ML樹構建之前，采用Modeltest軟件［33］確定序列最適合的進化模式，ML樹也用PAUP4.0bl0軟件構建，參數與MP法相同。采用Bootstrap檢驗分子系統(tǒng)樹各節(jié)點的置信值 (其中NJ和MP樹重復1000次，ML樹重復100次)。NJ樹、MP樹和ML樹拓撲結構的一致性用Templeton檢驗［34］評估。

2 結果

2.1 PCR擴增及序列分析

本研究中成功擴增并測序了兩種龜的R35內含子部分序列 (長度為1080 bp)以及6種龜的RAG2基因部分序列 (長682 bp)，所有序列均已提交GenBank數據庫 (登錄號見表1，用*示出)。其中，RAG2基因682 bp的核苷酸序列共編碼227個氨基酸，其中有59個發(fā)生變異。

將從NCBI上下載的其他龜鱉類R35序列和RAG2序列一并分析 (表1)，經比對后，R35的一致序列為941 bp，RAG2一致序列為620 bp，二者合并后得到1561 bp的一致序列，其中共有505個可變核苷酸位點，總變異率為32.35%;簡約信息位點有239個，單變異多態(tài)位點有 266個，插入/缺失為139個。堿基A、T、G、C的平均含量分別為29.5%、28.5%、22.8%、19.2%。A+T含量為58%，高于G+C含量42%。在505個核苷酸位點中，轉換數為54，顛換數為33，轉換/顛換比率 (R)為1.64。龜鱉目9個科間的K－2－P遺傳距離見表2，其中海龜科和鱷龜科之間的遺傳距離最小，為0.025;鱉科和南美側頸龜科之間的遺傳距離最大，為0.182。PHT檢驗顯示，P=0.02＞0.01，因此R35和RAG2序列可以合并。Modeltest檢測結果顯示，TVM+G為最佳模型，該模型的相關參數為:－ln L=6274.6504，K=8，AIC=12565.3008，伽馬分布的形狀參數 (Gamma distribution shape parameter)=1.2752。

基于轉換和顛換與遺傳距離的線性關系分析堿基替代飽和的結果，顯示堿基轉換和顛換在K－2－P遺傳距離小于0.195的范圍內均未達到替代飽和(圖1)。Iss的指數檢測結果顯示，在兩尾t檢驗下，P=0.0000，Iss值為0.1328，極端對稱樹臨界值Iss.c為0.7620，極端非對稱樹臨界值 Iss.c為0.5599，則Iss＜Iss.c，表明堿基替代未飽和。兩種檢驗方法都顯示這些序列堿基轉換和顛換均未達到替代飽和，因此可用于構建進化樹。

2.2 系統(tǒng)發(fā)生分析

Templeton檢驗顯示，基于R35/RAG2序列的NJ樹、MP樹和ML樹拓撲結構基本一致 (圖2)。分子系統(tǒng)樹顯示，根據傳統(tǒng)形態(tài)學劃分的各科成員均以較高的支持率聚在一起，說明基于R35/RAG2序列的系統(tǒng)樹能將各科清晰明確的區(qū)分開。其中潮龜科和陸龜科匯聚成一支后，再與龜科構成姐妹群(支持率大于95%)。棱皮龜科與海龜科聚在一起，爾后再與鱷龜科匯聚成一支，說明這三個科之間可能有較近的親緣關系。鱉科則位于樹的基部，推測鱉科可能是曲頸龜亞目中分化較早的科之一。

表1 24種龜及其R35和Rag2序列登陸號Tab.1 The R35＆Rag2 accession numbers of 24 turtle species

表2 龜鱉目9個科間的Kimura－2－paramete遺傳距離Tab.2 Kimura－2－parameter distances among 9 families in Testudinata

圖1 基于轉換和顛換對Kimura雙參數遺傳距離作圖檢測R35/RAG2序列飽和程度Fig.1 Saturation test of R35/RAG2 by transitional and transversional variation against K－2－P distances between pairs of taxa

圖2 基于龜鱉類R35/RAG2合并序列構建的分子系統(tǒng)樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the combined R35/RAG2 date sets of turtles and tortoises

3 討論

3.1 龜鱉類系統(tǒng)進化關系的分析

隨著分子生物學技術的發(fā)展，國內外有部分學者運用線粒體或核基因來研究龜鱉目的系統(tǒng)進化，解決了許多龜鱉類傳統(tǒng)形態(tài)學上有爭議的問題。然而，有關龜鱉類科水平或更高分類階元的系統(tǒng)關系問題還有一些不確定之處，如平胸龜科、海龜類(棱皮龜科和海龜科)、鱷龜科的進化位置及其親緣關系等［10］。

筆者構建的系統(tǒng)樹結果顯示，潮龜科與陸龜科匯聚后，再與龜科聚成姐妹群，且具有較高的支持率。從遺傳距離上看，潮龜科與陸龜科的遺傳距離(0.026)小于龜科和陸龜科的遺傳距離 (0.035)，顯示潮龜科與陸龜科之間的親緣關系較近，而潮龜科與龜科的親緣關系比與陸龜科要遠。因此，本研究結果印證了陸龜科與潮龜科關系較近的觀點［7，12，35－36］，同時也再次驗證 Gaffney 等［35］將 Mc-Dowell［36］定義的龜科中的潮龜亞科和龜亞科提升為潮龜科和龜科的科學性［36］。這也與萬全等［15］基于12SrRNA的研究結果一致。

本研究中構建的系統(tǒng)樹結果還顯示，陸龜總科，包括潮龜科、陸龜科和龜科與鱷龜科+海龜總科 (包括海龜科和棱皮龜科)構成姐妹群，有較高的支持率(MP=100，ML=92，NJ=100)，其中鱷龜科和海龜總科又是處于姐妹群的位置，其支持率均大于65(MP=68，ML=85，NJ=71)。這些與Krenz等［37］運用 RAG－1、Cytb、12S rRNA 序列重建的系統(tǒng)樹的結果一致，與Barley等［10］用14個核基因序列重建的系統(tǒng)樹結果也是一致的，但與Parham等［38］基于線粒體全基因組重建的系統(tǒng)樹結果有差異。線粒體基因和核基因的進化速率不同可能是造成這種差異的重要原因。

3.2 核基因標記在分子系統(tǒng)學上的適用性探討

傳統(tǒng)的系統(tǒng)進化分析多采用形態(tài)學和線粒體的數據來分析，然而，僅局限于這些數據的分析往往會產生一些誤差，甚至是錯誤的結論。因此，結合核內更多的分子數據來分析系統(tǒng)進化成為一種必然。本研究中，作者采用兩個核基因標記，其中關于重組激活基因 (RAGs)的研究比較成熟，RAGs較為保守，因此被廣泛用于動物系統(tǒng)進化及親緣關系分析［16－20］;采用的另外一個分子標記是RNA指紋蛋白35(R35)，該蛋白屬于多樣性的7次跨膜蛋白超級家族的成員，R35的編碼框編碼一段是由723個氨基酸殘基組成的多肽。然而，對于R35的具體功能還沒研究清楚，目前的研究顯示，R35是單拷貝基因，可能屬于一個新的G蛋白偶聯受體超家族。通過序列比對顯示，R35或許司職著G蛋白偶聯受體的作用，在小腦、骨髓、幼胚的神經節(jié)細胞中進行著發(fā)育的調節(jié)并高表達［21］。Friedel等［21］還指出R35基因有一段1000～2000 bp的內含子。R35基因的這一段內含子作為一種新的核內基因標記已被國外一些學者運用到龜鱉類動物的系統(tǒng)進化研究中［7，22］。

本研究中運用RAG2和R35這兩個核基因的數據來分析24種龜鱉類的系統(tǒng)進化關系，構建的三種系統(tǒng)樹均具有較高的支持率，從而更好地佐證了龜鱉類科階元及更高分類階元的一些進化關系。然而，研究龜鱉類的系統(tǒng)進化和親緣關系是極其復雜的工作，還需要通過更多的線粒體(如線粒體全基因組)和核內的分子數據相結合來做進一步的分析。

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