劉昕，李書芬，牛沂菲，賈長(zhǎng)虹，武臨專，王以光

格爾德霉素（geldanamycin，GDM）和安絲菌素（ansamitocin，ASM）分別是由吸水鏈霉菌（如streptomyces hygroscopicus17997）和珍貴橙色束絲放線菌（如actinosynnema pretiosumATCC 31565）產(chǎn)生的具有抗腫瘤活性的安莎類抗生素[1-2]。GDM 與 ASM 具有相同的生物合成機(jī)制：它們均以 3-氨基-5-羥基苯甲酸（AHBA）為特異性生物合成起始物，在 I 型聚酮合酶（PKS）作用下將 7 個(gè)二碳單位連接形成安莎鏈，在酰胺合酶的作用下將安莎鏈與AHBA 連接環(huán)化；再經(jīng)過 PKS 后修飾過程，形成 GDM 或ASM[3-4]。但是，GDM 與 ASM 的生物合成 PKS 后修飾存在顯著差異：GDM 的 PKS 后修飾包括羥基化、O-甲基化、氨甲?；脱趸?，ASM 的 PKS 后修飾包括鹵（氯）化、N-甲基化（或 N-糖基化[5]）、O-甲基化、?；h(huán)氧化和氨甲?；ōh(huán)化）等（圖1）。相對(duì)于 GDM，ASM 的 PKS后修飾似乎更加復(fù)雜。如果參與 ASM 生物合成的 PKS 后修飾系統(tǒng)可對(duì) GDM 生物合成中間產(chǎn)物（或 GDM 本身）發(fā)揮修飾作用，就可獲得新的格爾德霉素衍生物，從而為抗腫瘤藥物開發(fā)提供候選化合物?；谠撛O(shè)想，本文作者進(jìn)行了初步的探索研究。

圖1 ASM 與 GDM 具有相同的生物合成機(jī)制、不同的 PKS 后修飾示意圖

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 珍貴橙色束絲放線菌 ATCC 31565，ASM 產(chǎn)生菌；吸水鏈霉菌 17997，GDM 產(chǎn)生菌；吸水鏈霉菌 17997gdmN（氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶基因）阻斷變株，4,5-雙氫-7-去氨甲?；?7-羥基格爾德霉素（4,5-dihydro-7-descarbomoyl-7-hydroxygeldanamycin，CT-1-7）產(chǎn)生菌[6-7]；吸水鏈霉菌17997gdmP（細(xì)胞色素 P450 單氧化酶基因）基因阻斷變株，4,5-雙氫格爾德霉素（4,5-H2GDM）產(chǎn)生菌（同時(shí)產(chǎn)生少量 17-O-demethylreblastatin）[8-9]。上述菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存或構(gòu)建。

1.1.2 試劑 GDM、CT-1-7、4,5-H2GDM 和 17-O-demethylreblastatin，由本實(shí)驗(yàn)室分別從吸水鏈霉菌 17997、吸水鏈霉菌 17997gdmN阻斷變株、吸水鏈霉菌 17997gdmP阻斷變株的發(fā)酵產(chǎn)物中提??；GF254TLC 硅膠板為青島海洋化工分廠產(chǎn)品；葡萄糖、乙酸乙酯等普通化學(xué)試劑為北京化工廠化學(xué)或分析純產(chǎn)品；甲醇為美國(guó) Fisher 公司HPLC 級(jí)產(chǎn)品。

1.1.3 儀器 Agilent 1200 型高效液相色譜儀為美國(guó) Agilent公司產(chǎn)品；QTRAP 型質(zhì)譜為美國(guó) Applied Biosystems/MSD SCIEX 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 珍貴橙色束絲放線菌 ATCC 31565 的培養(yǎng) 甘油管冷凍保藏的珍貴橙色束絲放線菌 ATCC 31565 孢子懸液，接種于 MY 培養(yǎng)基（培養(yǎng)基組成：酵母提取物 0.4%，麥芽提取物 1.0%，葡萄糖 0.4%，瓊脂粉 1.5%），28℃培養(yǎng) 4～5 d。

1.2.2 生物轉(zhuǎn)化 珍貴橙色束絲放線菌 ATCC 31565 的每個(gè) MY 培養(yǎng)平皿（直徑 9cm），加入 CT-1-7 溶液（溶于二甲基亞砜，20 mg/ml）250 μl，終濃度 200 μg/ml，涂勻，28℃繼續(xù)培養(yǎng) 24～36 h。

1.2.3 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物提取 取一個(gè)生物轉(zhuǎn)化平皿，將其中的 MY 瓊脂培養(yǎng)物切碎為長(zhǎng)寬約 0.5cm×0.5cm 大小的瓊脂塊，轉(zhuǎn)入三角瓶中，加入約 40 ml 乙酸乙酯提取 24 h，傾出提取液，室溫?fù)]干后，用約 500 μl 乙酸乙酯復(fù)溶。

1.2.4 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物檢測(cè) 硅膠板 TLC 檢測(cè)，采用乙酸乙酯-二氯甲烷-正己烷-甲醇（9∶6∶6∶1）溶媒系統(tǒng)展層；展層結(jié)束后，用少量 NaOH（2.0 mol/L）溶液噴涂[10]，照相記錄。

1.2.5 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的 LC-MS/MS 分析 將目標(biāo)生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物從 TLC 硅膠板上刮下，乙酸乙酯洗脫回收并揮干，復(fù)溶于少量甲醇中，進(jìn)行 LC-MS/MS 分析。Agilent 1200 型液相色譜系統(tǒng)與 QTRAP LC-MS-MS 質(zhì)譜儀聯(lián)用，配Turbo Ionspray 離子化源。液相色譜條件：Dikma Diamonsil C18反相色譜柱，5 μm，150mm×4.6mm；30%～100%甲醇梯度洗脫 30min；流速 1 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng) 304 nm。質(zhì)譜檢測(cè)條件：噴霧電壓 5.5 kV；溫度 450℃；解簇電壓 80 V；霧化氣 40 相對(duì)單位，輔助氣 30 相對(duì)單位，均為氮?dú)?；全掃描監(jiān)測(cè)，正離子方式，質(zhì)荷比（m/z）范圍為100～1000；采用信息依賴掃描模式獲得二級(jí)質(zhì)譜；碰撞壓力設(shè)為高；碰撞能量為35 eV。

2 結(jié)果

2.1 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物 TLC 檢測(cè)結(jié)果

對(duì) 4,5-雙氫-7-去氨甲酰基-7-羥基格爾德霉素（CT-1-7，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2）。在珍貴橙色束絲放線菌 ATCC 31565 中的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行硅膠板 TLC 和 NaOH 顯色，發(fā)現(xiàn)有新的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物出現(xiàn)（圖3），并且與 4,5-H2GDM 具有相同的Rf值。

圖2 CT-1-7（左）和 4,5-H2GDM（右）的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖3 CT-1-7 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的硅膠板 TLC 檢測(cè)

2.2 LC-MS/MS 分析結(jié)果

圖4 4,5-H2GDM 的 LC-MS/MS 確證

從 TLC 硅膠板上回收轉(zhuǎn)化產(chǎn)物條帶后進(jìn)行 HPLC 分析，主峰的保留時(shí)間（24.47min）和紫外吸收光譜（圖4A）與 4,5-H2GDM 對(duì)照品一致，因此推測(cè)該化合物為4,5-H2GDM；對(duì)該化合物進(jìn)行質(zhì)譜分析（圖4B），顯示其分子量和二級(jí)質(zhì)譜特征均與 4,5-H2GDM 一致[11]，證實(shí)該化合物為4,5-H2GDM，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2。

3 討論

Hu 等[12]利用除莠霉素（herbimycin）與 GDM 的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似性，在除莠霉素產(chǎn)生菌——Streptomyces hygroscopicusAM 3672 中對(duì) GDM 進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化研究，獲得了格爾德霉素衍生物——15-羥基格爾德霉素。本文將 GDM 生物合成中間產(chǎn)物 4,5-雙氫-7-去氨甲?；?7-羥基格爾德霉素（CT-1-7）加入到 ASM 產(chǎn)生菌——珍貴橙色束絲放線菌Actinosynnema pretiosumATCC 31565 中，獲得了 4,5-雙氫格爾德霉素，說明參與 ASM 生物合成 PKS 后修飾的氨甲?；D(zhuǎn)移酶能夠識(shí)別并催化 CT-1-7 氨甲?；４送?，本文作者還分別利用珍貴橙色束絲放線菌 ATCC 31565 對(duì)GDM 以及另外一個(gè) GDM 生物合成中間產(chǎn)物（17-O-demethylreblastatin，即 17-hydroxy-progeldanamycin）[13]進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，但未檢測(cè)到生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，提示安絲菌素生物合成 PKS 后修飾除了氨甲?；酝獾钠渌揎棽襟E不能對(duì)格爾德霉素及其生物合成中間產(chǎn)物發(fā)生作用?？紤]到前格爾德霉素（progeldanamycin，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1）與前安絲菌素（proansamitocin，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1）在結(jié)構(gòu)上非常相似，今后如可獲得前格爾德霉素，還可采用前格爾德霉素作為生物轉(zhuǎn)化底物，探討獲得格爾德霉素衍生物（雜合抗生素）的可能性。

CT-1-7 在珍貴橙色束絲放線菌 ATCC 31565 中的氨甲?；a(chǎn)率較低（約 5%～10%），推測(cè)主要是由于在珍貴橙色束絲放線菌 ATCC 31565 中存在 ASM 生物合成中間產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)作用；預(yù)計(jì)阻斷 ASM 生物合成，可顯著提高其氨甲酰基化產(chǎn)率。

對(duì)參與 GDM 與 ASM 生物合成 PKS 后修飾的氨甲?；D(zhuǎn)移酶進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)（alignment），發(fā)現(xiàn)兩者有60%相同性（identities）、70%相似性（positives），因此，推測(cè)這兩個(gè)酶在空間結(jié)構(gòu)上非常相似；由于兩者所催化底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)又比較相似，它們?cè)诖呋δ苌峡梢曰ハ嗵鎿Q并不令人意外，本文的生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)此予以了證實(shí)。

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