姬宏莉，姬宏娟，馬永全，杜 芳，王 輝

腫瘤的發(fā)生不僅取決于核內(nèi)遺傳物質(zhì)，而且還與核外的線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）密切相關(guān)[1，2]。mtDNA是細(xì)胞內(nèi)唯一的核外遺傳物質(zhì)，具有可自主復(fù)制的DNA基因組。mtDNA是具有編碼區(qū)和非編碼區(qū)共16 569個(gè)堿基對(duì)的雙鏈閉環(huán)分子，其中編碼區(qū)含有37個(gè)基因，2種rRNA，22種tRNA和13種與線粒體氧化磷酸化有關(guān)的蛋白多肽基因；非編碼區(qū)由 1120bp（16025-576）的 D環(huán)（D-Loop）構(gòu)成[3]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)mtDNA的D環(huán)可能為mtDNA突變的熱點(diǎn)所在,但不同的實(shí)體腫瘤，有關(guān)該區(qū)突變的頻率報(bào)道存在明顯差異[4]。本實(shí)驗(yàn)通過將大腸癌細(xì)胞突變的mtDNA片斷轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，觀察NIH3T3的突變和多態(tài)性變化，以便明確變異的mtDNA造成腫瘤發(fā)病的機(jī)制和作用。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；mtDNA提取試劑盒購(gòu)自杭州V-gene生物科技公司；2×Pfu PCR MasterMix購(gòu)自北京TianGene生物科技公司。Lipofection2000TM轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invintrogen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株及質(zhì)粒 ①NIH3T3細(xì)胞株購(gòu)于南方醫(yī)院病理生理教研室；②大腸癌mtDNA的重組表達(dá)載體：在 pcDNA3.1（+）載體 BamH I，Xho I位點(diǎn)間插入1200bp的突變的大腸癌mtDNA的D環(huán)區(qū)，命名為 pcDNA3.1（+）-Sw480 mtDNA，pcDNA3.1（+）-Lovo mtDNA，由本課題組構(gòu)建。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) NIH3T3細(xì)胞在37℃，5%CO2飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%進(jìn)口胎牛血清（GIBCO）的DMEM高糖培養(yǎng)基，隔天換液1次，每4～5 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選 轉(zhuǎn)染前24 h將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NIH3T3細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為1×105個(gè)/ml，接種于六孔板中，用Lipofection2000TM將pcDNA3.1（+）-Sw480 mtDNA、pcDNA3.1（+）-Lovo mtDNA分別導(dǎo)入NIH3T3細(xì)胞，具體轉(zhuǎn)染操作過程參考 Invintrogen公司的Lipofection2000TM說明書及相關(guān)文獻(xiàn)[5]。置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換無抗生素的含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液，48 h后用 G418 200 μg/ml篩選，2周后挑選單克隆細(xì)胞群落，用含G418 100 μg/ml的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 mtDNA的提取 用杭州V-gene試劑公司的mtDNA提取試劑盒，采取膜裂解和膜選擇結(jié)合DNA的技術(shù)分離mtDNA。

1.3.4 PCR法擴(kuò)增mtDNA D-loop 參照mtDNA D-loop的全長(zhǎng)設(shè)計(jì)兩段引物并送上海博亞生物技術(shù)公司合成。Primer1 5’-tcgaattctttcatggggaagcaga tttgg-3’、Primer2 5’ -atggatccggaggtaagctacataaactg-3’，50 μl PCR 體 系 ：mtDNA 4 μl、Primer1 （25 μmol/L）2 μl、Primer2 （25 μmol/L）2 μl、2×MasterMix 25 μl、ddH2O 17 μl。PCR 條件：預(yù)變性 94 ℃ 3 min、以下變性 94℃ 30 s、復(fù)性 56℃ 30 s、延伸 72℃1 min共33個(gè)循環(huán)，結(jié)束延伸72℃ 5 min。并將PCR產(chǎn)物5 μl行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.5 PCR產(chǎn)物直接測(cè)序 轉(zhuǎn)染不同重組質(zhì)粒NIH3T3/Sw480-mtDNA、pcDNA3.1(+)-Lovo mtDN的序列與未轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞及基因庫(kù)數(shù)據(jù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer） 相比對(duì)。當(dāng)轉(zhuǎn)染大腸癌mtDNA重組載體的NIH3T3細(xì)胞D環(huán)的核苷酸序列與NIH3T3細(xì)胞相同，但與基因庫(kù)記載的不同時(shí)，這種改變?yōu)槎鄳B(tài)性變化；當(dāng)轉(zhuǎn)染大腸癌mtDNA重組載體的NIH3T3細(xì)胞D環(huán)的核苷酸序列與基因庫(kù)記載相同，但與NIH3T3細(xì)胞不同時(shí)，這種改變?yōu)槎鄳B(tài)性變化。發(fā)現(xiàn)突變后，為除外系統(tǒng)誤差，用 PCR重新擴(kuò)增線粒體 D環(huán)區(qū)，用不同的引物正反兩個(gè)方向再次測(cè)序以證實(shí)突變確實(shí)存在。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞mtDNA D-loop的鑒定結(jié)果 取上述 PCR產(chǎn)物 5 μl行 1%瓊脂糖凝膠電泳，80 V，45 min，可見一條清晰的1.2 kb目的基因條帶 （圖1）。用Vilber Lourmat凝膠成像圖像分析儀分析圖像。并送上海博亞生物技術(shù)公司正反雙向測(cè)序。

2.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞mtDNA D-loop測(cè)序變異結(jié)果 轉(zhuǎn)染不同重組質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）-Sw480 mtDNA、pcDNA3.1（+）-Lovo mtDN的序列與未轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞及基因庫(kù)數(shù)據(jù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer）相比對(duì)。分別檢測(cè)到轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-Sw480 mtDNA 的 NIH3T3細(xì)胞線粒體D環(huán)共有11個(gè)位點(diǎn)變化，包括5個(gè)突變，6個(gè)多態(tài)性變化，轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1（+）-Lovo mtDN的NIH3T3細(xì)胞線粒體D環(huán)共有8個(gè)位點(diǎn)變化，包括3 個(gè)突變，5 個(gè)多態(tài)性變化（表1、2）。

圖1 轉(zhuǎn)染前后NIH3T3細(xì)胞mtDNA D-loop電泳鑒定PCR結(jié)果

表1 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Sw480 mtDNA的NIH3T3細(xì)胞線粒體D環(huán)區(qū)變化位點(diǎn)

表2 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-lovo mtDNA的NIH3T3細(xì)胞線粒體D環(huán)區(qū)變化位點(diǎn)

3 討 論

腫瘤的發(fā)生都是一個(gè)多因素作用，表現(xiàn)為多階段的復(fù)雜過程。線粒體 DNA的突變?cè)谀[瘤發(fā)病中的作用和機(jī)制的研究還處在起步階段。與cDNA相比，mtDNA更加脆弱，突變率更高。近來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生與線粒體DNA突變導(dǎo)致功能的改變密切相關(guān)。在大腸、肝、肺、胃等臟器以及血液系統(tǒng)的惡性腫瘤中，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)mtDNA的畸變[6-9]。Habano等[10]也報(bào)道了D環(huán)區(qū)的突變能引起蛋白質(zhì)合成改變，影響線粒體的功能，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響，推測(cè)線粒體基因改變將引起其功能異常，釋放大量活性氧自由基，而這些活性氧自由基能造成核基因損傷，從而引起各種腫瘤的發(fā)生。以往的所有研究均集中在發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞或組織中存在mtDNA突變的現(xiàn)象，而mtDNA突變對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制則涉及尚少。為進(jìn)一步研究mtDNA突變與腫瘤發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在聯(lián)系，筆者選取NIH3T3細(xì)胞為惡性轉(zhuǎn)化的靶細(xì)胞，將突變大腸癌細(xì)胞的mtDNA轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞mtDNA的D環(huán)區(qū)的突變情況，以進(jìn)一步明確mtDNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

本研究共檢測(cè)到9個(gè)位點(diǎn)變化，其中16 314位T→C，75位C→T，這2個(gè)位點(diǎn)變化在轉(zhuǎn)染不同重組質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞中均檢測(cè)到，考慮為多態(tài)性變化。在轉(zhuǎn)染不同重組質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞中均檢測(cè)到了與正常NIH3T3細(xì)胞和基因庫(kù)記載不同的核苷酸變化，考慮為突變。在 8個(gè)突變位點(diǎn)中，除在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-Sw480 mtDNA的NIH3T3細(xì)胞線粒體DNA D環(huán)區(qū)的16 437位和16 438位間檢測(cè)插入序列G，另外的7個(gè)突變形式均為堿基置換。在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-Sw480 mtDNA的NIH3T3細(xì)胞中檢測(cè)到16 223位 C→T，16 225位 T→C，16 237位 C→G，16 273位C→T，211位 A→T； 在轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1 （+）-Lovo mtDN的NIH3T3細(xì)胞中檢測(cè)到 16 223位 C→T，16 225位C→T，665位C→T。因此，在轉(zhuǎn)染不同重組質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞中，同時(shí)檢測(cè)到16 223位C→T，16 225位T→C，檢測(cè)到的相同的突變位點(diǎn)考慮為特征性改變，而這些特征性的改變目前認(rèn)為可能和腫瘤的易感性有關(guān)，但是否致癌有待于進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，將大腸癌突變的線粒體 DNA導(dǎo)入到NIH3T3中，能夠誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞線粒體DNA的D環(huán)區(qū)發(fā)生突變和多態(tài)性的變化，從而證實(shí)大腸癌線粒體DNA的D環(huán)區(qū)是一具有高突變性的區(qū)域，在一定程度上具有誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的傾向，然而在腫瘤發(fā)病中的作用和機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

[1]Li Yan,Weibing Song,Liu Hong,et al.Mitochondrial DNA from colotectal cancer cells promotes the malignant phenotype of NIH3T3 cells.Cell Biology International,2008,32（10）:979-983.

[2]Astrid Lièvre,Caroline Chapusot,Anne-Marie Bouvier,et al.Clinical value of mitochondrial mutations in colorectal cancer.J Clin Oncol,2005,23:3517-3525.

[3]Daozhen Chen,Huiying Zhan.Study on the mutations in the D-loop region of mitochondrial DNA in cervical carcinoma.J Cancer Res Clin Oncol,2009,135(3):291-295.

[4]Lee HC,Yin PH,Lin JC,et al.Mitochondrial genome instability and mtDNA depletion in human cancers.Ann N Y Acad Sci,2005,1042:109-122.

[5]Suzuki R,Oda Y,Namai E,et al.Development of site specific gene delivery system with sonoporation.Yakugaku Zasshi,2008,128(2):187-92.

[6]Akouchekian M,Houshmand M,Hemati S,et al.High rate of mutation in mitochondrial DNA displacement loop region in human colorectal cancer.Dis Colon Rectum,2009,52(6):526-30.

[7]Daozhen Chen,Huiying Zhan.Study on the mutations in the D-loop region of mitochondrial DNA in cervical carcinoma.J Cancer Res Clin Oncol,2009,135(3):291-295.

[8]Ling-Juan Pang,Jian-Yong Shao,Xiao-Man Liang,et al.Mitochondrial DNA somatic mutations are frequent in nasopharyngeal carcinoma.Cancer Biology&Therapy,2008,7(3):198-207.

[9]Shih-Ching Chang,Pei-Ching Lin,Shung-Haur Yang,et al.Mitochondrial D-loop mutation is a common event in colorectal cancers with p53 mutations.Int J Colorectal Dis,2009,24(7):623-628.

[10]Habano W,Sugai T,Nakamura SI,et al.Microsatellite instability and mutation ofmitochondrial and nuclear DNA in gastric carcinoma.Gastroenterology,2000,118:8352-841.