王小磊 高 冰 楊歡歡 陳 璐

目前，我國(guó)蛋白質(zhì)飼料資源嚴(yán)重匱乏，自給率不足50%，并且由于動(dòng)物性蛋白供應(yīng)日趨緊張，使得植物性蛋白飼料在飼料中的應(yīng)用逐漸增加。用量最大、也是最為重要的一類(lèi)植物性蛋白質(zhì)飼料是餅粕類(lèi)。其中棉籽餅粕富含蛋白質(zhì)，是很好的動(dòng)物飼料蛋白資源。

我國(guó)是產(chǎn)棉大國(guó)，年產(chǎn)棉l 000萬(wàn)以上。棉籽經(jīng)榨油后得到的餅粕中含蛋白質(zhì)30%～40%，且其蛋白質(zhì)的氨基酸成分比較完全，另外棉籽餅粕還含有糖、脂肪、磷脂、維生素、纖維素等，可作為優(yōu)質(zhì)的飼料資源。但是，因其含有對(duì)動(dòng)物有毒的游離棉酚，其利用價(jià)值和使用量受到極大限制，故我國(guó)棉籽餅粕飼料的利用率不足30%，從而也制約著我國(guó)畜牧業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。

近年來(lái)，隨著對(duì)棉籽餅粕生物脫毒法的不斷研究與改進(jìn)，脫毒工藝已經(jīng)由單菌種發(fā)酵脫毒發(fā)展到多菌種混合發(fā)酵脫毒。吳偉偉應(yīng)用酵母菌等菌種，熊巍等應(yīng)用地衣芽孢桿菌等多菌種混合發(fā)酵棉籽餅粕后，脫毒率均達(dá)90%以上。因此，采用微生物發(fā)酵法，不僅能安全脫毒，還能提高棉籽餅粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，使其更好地應(yīng)用于畜牧業(yè)。發(fā)酵過(guò)程中適當(dāng)應(yīng)用益生菌，已受到越來(lái)越多的關(guān)注。

益生菌不僅能促進(jìn)飼料中營(yíng)養(yǎng)素降解，使動(dòng)物對(duì)飼料的吸收利用更充分，還具有獨(dú)特的生物奪氧作用機(jī)制，能抑制致病菌的生長(zhǎng)繁殖，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)胃腸道正常菌群、維持微生態(tài)平衡，從而改善胃腸道功能，提高食物消化率和生物效價(jià)，降低血清膽固醇，控制內(nèi)毒素，抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長(zhǎng)，提高機(jī)體免疫力。

本研究擬采用地衣芽孢桿菌、乳酸菌、釀酒酵母等菌種對(duì)棉籽餅粕進(jìn)行發(fā)酵，以去除棉籽餅粕中的游離棉酚及降解棉籽餅粕中大分子蛋白和降低抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，并且生產(chǎn)的飼料中含有大量益生菌、蛋白酶、短肽和乳酸等生物活性物質(zhì)，最終得到一種有利于動(dòng)物消化吸收和生長(zhǎng)發(fā)育等功效的生物活性飼料。由于本研究組對(duì)于多菌種混合發(fā)酵棉籽餅粕脫除游離棉酚的研究已經(jīng)較成熟，因此，本研究重點(diǎn)介紹在脫毒基礎(chǔ)上的益生菌生物活性飼料的生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 菌株及原料

霉菌XH001、霉菌XH002、地衣芽孢桿菌E01、枯草芽孢桿菌E02、乳酸菌SR01均為武漢工業(yè)學(xué)院生工院409實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；釀酒酵母和飼料酵母購(gòu)自湖北安琪酵母股份有限公司；棉籽餅粕、麩皮、蘋(píng)果渣均由湖北鳳池實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，水1000 ml，pH值自然。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.3 g、蛋白胨1 g、氯化鈉 0.5 g、瓊脂 2 g、蒸餾水 100 ml，pH 值 7.0～7.2。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖 20.0 g、吐溫 801.0 ml、磷酸氫二鉀 2.0 g、乙酸鈉 5.0 g、檸檬酸三銨 2.0 g、硫酸鎂 0.2 g、硫酸錳0.05 g、瓊脂粉 15.0 g，蒸餾水 1000 ml，pH 值 6.2。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 有效活菌數(shù)的檢測(cè)

霉菌、芽孢桿菌、乳酸菌計(jì)數(shù)采用平板稀釋涂布法，分別用PDA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基，涂布平板培養(yǎng)，數(shù)菌數(shù)。酵母菌數(shù)的測(cè)定按GB／T4789.15—2003 執(zhí)行。

1.3.2 粗蛋白和氨基酸態(tài)氮的檢測(cè)

氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定采用甲醛滴定法，粗蛋白含量的測(cè)定采用凱氏定氮法。

1.4 原料配比

原料由60%餅粕、20%蘋(píng)果渣、20%麩皮組成。各原料粗蛋白含量見(jiàn)表1?；旌虾笤洗值鞍缀繛?7.58%。

表1 原料的粗蛋白含量

1.5 工藝流程

工藝流程說(shuō)明：混合均勻后的原料按1：1加水后進(jìn)行蒸煮，蒸煮后原料含水量為50%左右，接種發(fā)酵，霉菌與酵母菌發(fā)酵一段時(shí)間后接入芽孢桿菌(E01：E02=1：1)，繼續(xù)發(fā)酵12h后接入乳酸菌種子液，繼續(xù)發(fā)酵24 h，然后在45℃下低溫干燥至飼料含水量小于15%。

1.6 發(fā)酵條件研究

1.6.1 霉菌與酵母菌接種比例的研究

兩種霉菌接種量相同，兩組酵母菌接種量相同。霉菌與酵母菌接種比例分別為1：0.8、1：1和1：1.2，在霉菌與酵母菌發(fā)酵12 h后接入芽孢桿菌 (E01：E02=1：1)，然后按上述工藝流程進(jìn)行。每個(gè)處理取100 g固體發(fā)酵料接種，裝入塑料筐中，覆蓋紗布后放入恒溫、恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)各菌種菌數(shù)、粗蛋白及氨基酸態(tài)氮含量。

1.6.2 芽孢桿菌接入時(shí)間的研究

分別于霉菌、酵母菌混合發(fā)酵8、12、16 h后接入芽孢桿菌 (E01：E02=1：1)繼續(xù)發(fā)酵12 h后接入乳酸菌種子液，按上述工藝流程進(jìn)行。每個(gè)處理取100 g固體發(fā)酵料接種，裝入塑料筐中，覆蓋紗布后放入恒溫、恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，發(fā)酵完成后檢測(cè)各菌種菌數(shù)、粗蛋白及氨基酸態(tài)氮含量。

1.6.3 乳酸菌接種量的研究

霉菌與酵母菌接種比例為1：1，發(fā)酵12 h后接入芽孢桿菌(E01：E02=1：1)，繼續(xù)發(fā)酵24 h后乳酸菌種子液接種量分別為5%、10%、15%，然后按上述工藝流程進(jìn)行。每個(gè)處理取100 g固體發(fā)酵料接種，裝入塑料筐中，覆蓋紗布后放入恒溫、恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，發(fā)酵完成后檢測(cè)各菌種菌數(shù)、粗蛋白及氨基酸態(tài)氮含量。

1.6.4 綜合條件的研究

對(duì)于發(fā)酵條件研究，采用5因素、4水平正交試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 霉菌與酵母菌接種比例對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響(見(jiàn)表2)

表2 霉菌與酵母菌不同接種比例后發(fā)酵效果

由表2可以看出，不同接種比例接種發(fā)酵后，飼料粗蛋白含量無(wú)顯著變化(P>0.05)，氨基酸態(tài)氮及活菌數(shù)亦無(wú)顯著變化 (P>0.05)。但是接種比例為1：1時(shí)，發(fā)酵結(jié)果較好。

2.2 芽孢桿菌接入時(shí)間對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響(見(jiàn)表3)

表3 不同芽孢桿菌接入時(shí)間對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

由表3可以看出，芽孢桿菌(E01：E02=1：1)的接入時(shí)間對(duì)發(fā)酵后粗蛋白含量、氨基酸態(tài)氮含量及有效活菌數(shù)的影響顯著(P＜0.05)。同時(shí)可以看出，在霉菌和酵母菌發(fā)酵12 h后接入芽孢桿菌，發(fā)酵效果更好，且發(fā)酵后飼料粗蛋白含量顯著增加。

2.3 乳酸菌接種量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響(見(jiàn)表4)

表4 不同乳酸菌接種量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

由表4可以看出，乳酸菌接種量的不同對(duì)發(fā)酵后粗蛋白含量、氨基酸態(tài)氮含量及有效活菌數(shù)的影響顯著(P＜0.05)。當(dāng)乳酸菌接種量為10%時(shí)，發(fā)酵效果最佳。

2.4 工藝條件的確定

根據(jù)單因素試驗(yàn)，設(shè)計(jì)5因素（溫度、原料含水量、芽孢桿菌接入時(shí)間、乳酸菌接種量和發(fā)酵時(shí)間）4水平L16(45)的正交試驗(yàn)進(jìn)行發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化。由于在早期發(fā)酵試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)霉菌與酵母菌接種比例對(duì)于后期多菌種混合發(fā)酵影響不大，故正交試驗(yàn)中忽略此因素的影響，而是增加了發(fā)酵的幾個(gè)基礎(chǔ)因素如溫度、原料含水量和總發(fā)酵時(shí)間。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表5所示，正交試驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表6。

表5 發(fā)酵工藝條件

由表5可知，影響粗蛋白含量的最佳發(fā)酵條件為A3B3C3D2E2，即發(fā)酵溫度為32℃，原料含水量為50%，芽孢桿菌接入時(shí)間為發(fā)酵后12 h，乳酸菌接種量為10%，發(fā)酵時(shí)間為48 h，與單因素試驗(yàn)結(jié)果相同。同時(shí)，對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響因素為A＞B＞C＞E＞D，即發(fā)酵溫度＞原料含水量＞芽孢桿菌接入時(shí)間＞發(fā)酵時(shí)間＞乳酸菌接種量。

驗(yàn)證試驗(yàn)后，發(fā)酵飼料粗蛋白含量達(dá)到37.92%，氨基酸態(tài)氮含量為1.88%，乳酸菌活菌數(shù)達(dá)2.3億cfu/g（干基），芽孢桿菌達(dá)18.4億cfu/g（干基）。

3 結(jié)論與展望

本試驗(yàn)以棉籽餅粕與蘋(píng)果渣、麩皮混合為原料，加水后對(duì)原料進(jìn)行蒸煮，待冷卻后接入菌種進(jìn)行混合菌種發(fā)酵，最佳工藝條件為：發(fā)酵溫度為32℃，原料含水量為50%，芽孢桿菌(E01：E02=1：1)接入時(shí)間為發(fā)酵后12 h，乳酸菌接種量為10%，發(fā)酵時(shí)間為48 h。發(fā)酵后飼料粗蛋白含量由原來(lái)的27.58%提高到37.92%，氨基酸態(tài)氮含量為1.88%，乳酸菌活菌數(shù)達(dá)2.3億cfu/g（干基），芽孢桿菌達(dá)18.4億cfu/g（干基）。

益生菌生物活性飼料的感官及適口性有很大改善，以后將對(duì)此進(jìn)行更深一步的研究。本研究的應(yīng)用及推廣，將極大提高棉籽餅粕的利用率，促進(jìn)對(duì)益生菌飼料的研究，改善我國(guó)蛋白飼料資源匱乏的局面，更好地促進(jìn)我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展。

若干篇，刊略，需者可函索）