林丁盛 張義鵬 鄭鑫 李志杰

隨意型皮瓣因取材方便和靈活而廣泛應(yīng)用于臨 床組織缺損的修復(fù)和重建。但隨意型皮瓣的長(zhǎng)寬比一般不超過2∶1。一旦超出該長(zhǎng)寬比，皮瓣遠(yuǎn)端容易發(fā)生缺血壞死，這極大地限制了它在臨床上的應(yīng)用。如果在增加隨意型皮瓣長(zhǎng)寬比例的同時(shí)改善皮瓣微循環(huán)、增加血運(yùn)，可保證較高的成活率，對(duì)提高臨床隨意型皮瓣的應(yīng)用范圍有重要意義。疏血通注射液具有抗凝、溶栓、促纖溶、抗血小板聚集、細(xì)胞保護(hù)等作用。我們研究疏血通注射液對(duì)大鼠隨意型皮瓣成活的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及動(dòng)物

疏血通注射液(批號(hào)100403-1)購自牡丹江友搏藥業(yè)有限責(zé)任公司，小鼠抗大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗體購自美國(guó)Santa Cruz公司，山羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋公司。健康的Sprague Dawley大鼠24只(由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，雌雄不拘，體質(zhì)量150～200 g，2～3個(gè)月齡。

1.2 模型制備及分組

將大鼠隨機(jī)分為疏血通實(shí)驗(yàn)組和生理鹽水對(duì)照組，每組12只。10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉;將動(dòng)物俯臥位固定，脫毛、碘伏消毒、鋪巾，采用改良McFarlane皮瓣制作方法［1］，以大鼠背部?jī)慎尼者B線為蒂，在背部正中設(shè)計(jì)一長(zhǎng)9 cm、寬3 cm矩形隨意型皮瓣，沿設(shè)計(jì)線切開皮膚、皮下組織達(dá)深筋膜淺層，保留真皮下毛細(xì)血管網(wǎng)，于深筋膜淺層表面分離皮下組織，遇到軸型血管即以4-0絲線結(jié)扎。皮瓣完全掀起后，徹底止血，立即用4-0縫線距皮緣0.5 mm、間距1 mm原位間斷縫合。切口周圍聚維酮碘消毒后涂抹金霉素軟膏，兩組在手術(shù)后立即經(jīng)腹腔注射藥物。實(shí)驗(yàn)組腹腔內(nèi)注射疏血通注射液1.5 mL·kg－1· d－1，對(duì)照組腹腔內(nèi)注射滅菌生理鹽水 1.5 mL·kg－1· d－1，均單籠飼養(yǎng)。為減少手術(shù)操作帶來的誤差，所有手術(shù)由同一人完成。

1.3 標(biāo)本處理

注射后第7天將大鼠處死，將皮瓣3等分(見圖1)，分別在皮瓣近蒂部(Ⅰ區(qū))、中部(Ⅱ區(qū))和遠(yuǎn)端(Ⅲ區(qū))切取組織標(biāo)本［2］。用10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水包埋切片行HE染色，光鏡觀察。

采用Elivison二步法進(jìn)行免疫組化檢測(cè)VEGF表達(dá)。石蠟切片置于60℃烘箱中，烘片60 min。在微波爐里加熱0.01 mol枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)至沸騰后將組織防脫片放入，中高火加熱7 min;取出微波盒流水自然冷卻。從緩沖液中取出玻片，蒸餾水沖洗，PBS沖洗，每張切片加1滴3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，滴加一抗50 μL，4℃過夜。37℃復(fù)溫45 min，PBS 沖洗，滴加二抗 50 μL，37 ℃ 孵育 1 h，PBS沖洗，DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，PBS沖洗，蘇木精復(fù)染1 min，蒸餾水浸泡，脫水和透明，封片和鏡檢。

圖1 大鼠背部隨意型皮瓣設(shè)計(jì)及分區(qū)示意圖

1.4 皮瓣存活面積比的檢測(cè)

術(shù)后1～7 d，每天肉眼觀察皮瓣存活狀況(顏色、質(zhì)地、壞死面積等)并記錄。術(shù)后第7天，各組大鼠在麻醉狀態(tài)下用透明紙覆蓋，準(zhǔn)確測(cè)量皮瓣成活或壞死面積，并剪成成活或壞死兩部分，分別以電子秤測(cè)質(zhì)量。按以下公式計(jì)算皮瓣存活面積比:皮瓣存活面積比=皮瓣存活面積玻璃紙質(zhì)量÷皮瓣總表面積玻璃紙質(zhì)量×100%。皮瓣壞死標(biāo)準(zhǔn):皮瓣顏色發(fā)黑，組織回縮、彈性差，質(zhì)地堅(jiān)硬，切割組織不出血;病理表現(xiàn)為組織崩解、細(xì)胞核消失、炎癥細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)、有局灶出血。

1.5 皮瓣組織學(xué)檢測(cè)

于皮瓣術(shù)后第7天取皮瓣標(biāo)本，OCT包埋劑包埋，液氮中保存，冰凍切片厚度為5 mm，進(jìn)行HE染色。100倍光鏡下觀察肉芽組織層厚度、組織水腫、壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等情況，并進(jìn)行微血管密度檢測(cè)。計(jì)數(shù)方法為:每組1張切片，每張切片在中央?yún)^(qū)和周邊區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)高倍(放大200倍)視野，血管計(jì)數(shù)后取其平均數(shù)。每高倍鏡野為0.305 mm2，計(jì)算出單位面積微血管數(shù)目(個(gè)/mm2)作為評(píng)價(jià)微血管密度的指標(biāo)。

1.6 VEGF 檢測(cè)

在光學(xué)顯微鏡下觀察經(jīng)免疫組織化學(xué)Elivison二步法檢測(cè)VEGF的組織切片，先用低倍鏡尋找陽性表達(dá)密集區(qū)域，然后改用高倍鏡觀察。每張片子選取5個(gè)高倍(放大400倍)視野，用配套的圖像采集系統(tǒng)拍攝保存。拍攝過程中，白平衡、光圈、快門時(shí)間等參數(shù)設(shè)定保持一致。將保存的圖片導(dǎo)入Image-Pro Plus v 6.0軟件，選擇需要分析的指標(biāo)“累積吸光度IA值”，讀取IA數(shù)值進(jìn)行測(cè)量，作為評(píng)價(jià)VEGF表達(dá)的指標(biāo)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。GraphPad.Prism 5.0制圖，檢測(cè)結(jié)果分析采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組皮瓣大體形態(tài)學(xué)比較

術(shù)后第1天，兩組皮瓣均出現(xiàn)不同程度的腫脹，Ⅲ區(qū)呈暗紫色，但無明顯壞死;術(shù)后第3天，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組皮瓣Ⅱ區(qū)和Ⅲ區(qū)出現(xiàn)局灶狀、小片狀壞死，壞死部分多呈紅褐色，有淤血;術(shù)后第7天兩組皮瓣Ⅱ區(qū)和Ⅲ區(qū)壞死部分均趨于融合，有黑色痂殼出現(xiàn)，手感變硬，皮瓣分界基本穩(wěn)定(見圖2)。

圖2 兩組大鼠隨意型皮瓣術(shù)后大體形態(tài)觀察

2.2 兩組皮瓣存活面積比比較

實(shí)驗(yàn)組皮瓣的存活面積比為(72.52±2.23)%，對(duì)照組皮瓣存活面積比為(50.36±2.37)%，兩組皮瓣的存活面積比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.506×10－5，P ＜0.01)。

2.3 兩組皮瓣組織學(xué)檢測(cè)

兩組皮瓣術(shù)后第7天的Ⅲ區(qū)組織學(xué)形態(tài)相似，均表現(xiàn)為急性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，90%肉膜層表現(xiàn)為肌纖維變性壞死。實(shí)驗(yàn)組Ⅰ區(qū)存活情況與對(duì)照組相比，組織水腫、血管擴(kuò)張、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較輕(見圖3)。實(shí)驗(yàn)組新生血管計(jì)數(shù)Ⅰ區(qū)(34.71 ±6.37)個(gè)/mm2，Ⅱ區(qū)(27.42±4.21)個(gè)/mm2;對(duì)照組新生血管計(jì)數(shù)Ⅰ區(qū)(32.71 ±5.36)個(gè)/mm2，Ⅱ區(qū)(17.45 ±5.43)個(gè)/mm2;兩組Ⅲ區(qū)皮瓣均壞死。兩組皮瓣Ⅰ區(qū)微血管密度差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.269，P ＞0.05)，Ⅱ區(qū)微血管密度實(shí)驗(yàn)組大于對(duì)照組(t=3.800 ×10－3，P ＜0.05)。

圖3 兩組Ⅱ區(qū)皮瓣組織學(xué)觀察(HE染色)

2.4 兩組皮瓣VEGF檢測(cè)結(jié)果比較

兩組免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖4。VEGF的IA值實(shí)驗(yàn)組為4731.24 ±448.99，對(duì)照組為2466.01 ±801.67，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.320 ×10－3，P ＜0.01)。

圖4 兩組血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)(免疫組織化學(xué) ×400)

3 討論

隨意型皮瓣是臨床上修復(fù)創(chuàng)面、重建功能、改善外形常用的皮瓣，但在臨床超過一定長(zhǎng)寬比其遠(yuǎn)端易發(fā)生缺血壞死，這可能與血供不足、缺血再灌注損傷以及細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的參與等有直接關(guān)系［3-4］。

疏血通注射液是一種行氣活血中成藥，其主要成分是水蛭和地龍［5-6］。其中水蛭最主要的提取物是水蛭素。水蛭素是目前發(fā)現(xiàn)作用最強(qiáng)的凝血酶特異性抑制劑，具有很強(qiáng)的抗凝作用。它通過與凝血酶直接結(jié)合而發(fā)揮抗凝作用，同時(shí)抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板激活，具有明顯的抑制血小板聚集作用;另外水蛭素有直接溶解血栓和抗血栓形成作用，它不僅可以與血漿中游離的凝血酶結(jié)合，還可中和與纖維蛋白結(jié)合的凝血酶，用于治療各種原因引起的血栓［7］。研究表明，局部運(yùn)用水蛭素對(duì)皮瓣靜脈淤血有明顯的防治作用［8-9］。疏血通注射液的另外一種成分是地龍，其提取物中含有蚓激酶，也是一種高效抗凝、促纖溶作用物質(zhì)。在體外具有很強(qiáng)的纖溶活性，在體內(nèi)、體外能夠促進(jìn)組織纖溶酶原激活物的表達(dá)，具有促進(jìn)血栓溶解、恢復(fù)血流灌注，并防止血栓再次形成的作用，對(duì)于改善血液循環(huán)有一定的意義［10］。

缺血組織中組織因子的水平增高［3］，組織因子與Ⅶ因子結(jié)合是血液凝固的一條主要途徑，阻止兩者的結(jié)合可以抑制血栓形成，增加皮瓣血供，從而提高皮瓣存活率。全身應(yīng)用疏血通注射液能有效降低缺血皮瓣的壞死，并有利于早期皮瓣的存活，可能與上述物質(zhì)相互作用，防止血栓形成，改善局部皮瓣血液循環(huán)有關(guān)。在本文資料中，實(shí)驗(yàn)組皮瓣存活面積明顯大于對(duì)照組證實(shí)了疏血通注射液在改善局部皮瓣血液循環(huán)中的作用。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“氣血相關(guān)”，“行氣通脈”，“補(bǔ)氣活血”，“脈者血之府也”，因此具有行氣活血作用的中藥可能具有促血管生成作用，這為中藥促血管生成奠定了理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在皮瓣壞死與存活并存的Ⅱ區(qū)，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)大量的新生血管，血管密度增大。有研究表明:VEGF直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞促其增殖分化，促進(jìn)皮瓣的毛細(xì)血管新生，提高再生血管的數(shù)量和質(zhì)量，加快皮瓣與受區(qū)及皮瓣與切緣之間的血運(yùn)重建，改善皮瓣遠(yuǎn)端微循環(huán)，從而促進(jìn)皮瓣成活［11］。疏血通注射液可以促進(jìn)糖尿病后肢缺血大鼠腓腸肌中VEGF表達(dá)增加［12］，以及缺血腦組織中VEGF的表達(dá)［13］，從而促進(jìn)毛細(xì)血管生成，發(fā)揮保護(hù)作用。本研究也觀察到實(shí)驗(yàn)組皮瓣VEGF表達(dá)較對(duì)照組增多，這提示疏血通注射液可能作用于缺血皮瓣，通過增加VEGF等血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)以增加皮瓣局部新生血管增生、提高血管密度，最終促進(jìn)皮瓣的存活。

應(yīng)用疏血通注射液能有效刺激新生血管增生，降低炎癥反應(yīng)，減少缺血皮瓣的壞死，并有利于提高超長(zhǎng)隨意型皮瓣的成活，有望解決皮瓣遠(yuǎn)端易壞死的臨床問題，但具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

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