韓 寧 丁素菊 吳丹紅

腦出血后存在神經(jīng)細(xì)胞凋亡已經(jīng)為許多研究所證實(shí)。Qureshi等發(fā)現(xiàn)ICH患者發(fā)病后24 h內(nèi)的血腫周圍組織中即可檢測到凋亡細(xì)胞，5d時(shí)仍存在凋亡現(xiàn)象［1］。Xue等在大鼠自體動脈血ICH模型的研究中發(fā)現(xiàn)，術(shù)后4 h即開始出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，并可持續(xù)4周［2］。另有研究發(fā)現(xiàn)，自由基與細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系，腦出血后由于周圍組織缺血、紅細(xì)胞破裂、鐵離子釋放及炎癥反應(yīng)等，促使自由基大量生成，而自由基可以通過損傷DNA、影響信號傳導(dǎo)以及參與表達(dá)調(diào)控等介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們前期研究發(fā)現(xiàn)大鼠腦出血模型中自由基和細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)［3］。

目前研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡途徑主要有三條，包括線粒體途徑、死亡受體途徑（TNF受體途徑）及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。已有大量研究證實(shí)，線粒體途徑和神經(jīng)系統(tǒng)凋亡密切相關(guān)，腦出血后Cyto C釋放是神經(jīng)細(xì)胞凋亡的一個(gè)關(guān)鍵事件［4］。對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和死亡受體途徑在腦出血后細(xì)胞凋亡中的作用及其與自由基的相關(guān)性目前研究較少。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級雄性SD大鼠，體重300g左右，購于中科院。多克隆的兔抗Caspase－3抗體、FITC標(biāo)記的綿羊抗兔IgG抗體、DAB染色試劑盒購自武漢博士德公司，多克隆兔抗TNF－α抗體、抗體稀釋凍干粉、多克隆兔抗Caspase－8抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，HRP－抗兔Ig G抗、tween－20、Hoechst染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，Triton－100購自AppliChem公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立參照 Deinsberger［5］、周中和等［6］報(bào)道方法，采用二次注血／退針法制備大鼠ICH模型，大鼠稱重后給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.4 g／kg）；大鼠麻醉后俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀［7］上，門齒溝水平比耳間線低2.6 mm；常規(guī)備皮消毒、切開，選擇注射點(diǎn)為尾殼核，將微量注射儀尖端定位于前囟前0.5 mm，中線旁開3 mm，垂直進(jìn)針6 mm，用微型手鉆在此鉆一直徑0.5 mm的小孔；用1 ml注射器取大鼠自體股靜脈不凝血80μl，沿所鉆小孔進(jìn)針6 mm（相當(dāng)于大鼠尾殼核部位），先注入20μl，停針2 min后繼續(xù)緩慢注入60μl（2 min內(nèi)均勻注入）后，留針約2 min，退針2 mm，再停針約2 min，緩慢將注射器完全退出。假手術(shù)組為只進(jìn)針到尾殼核后不注血，停針6 min后退針。骨蠟封閉顱骨創(chuàng)口，縫合頭皮及大腿內(nèi)側(cè)皮膚，局部皮膚用碘汀消毒，置于溫暖環(huán)境中直至清醒。

1.2.2 模型成功判斷

大鼠蘇醒后參照Bederson［8］法進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評分，即0分：前爪伸直，無神經(jīng)功能缺損；1分：腦部病變對側(cè)腕關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)屈曲，肩內(nèi)收屈曲；將尾巴提起，癱瘓側(cè)前肢回收屈曲于腹下（正常側(cè)前肢向地面伸展）；2分：上述體征＋向麻痹側(cè)推阻力下降；3分：活動時(shí)向麻痹側(cè)打圈（呈追尾狀）。評分≥2分者入選。

1.2.3 分組

將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、依達(dá)拉奉干預(yù)組（1 mg／kg、3 mg／kg）。模型組和兩種劑量的干預(yù)組又各自分為6、12、24、48、72 h、7、14 d七個(gè)亞組。假手術(shù)組（n＝6），模型組和依達(dá)拉奉干預(yù)組（兩個(gè)劑量）每一亞組（n＝6）。

依達(dá)拉奉干預(yù)組于造模成功后1 h給予依達(dá)拉奉腹腔注射（3 mg／kg組以藥物原液注射，1 mg／kg將原液稀釋為相同容量后注射），1次／24 h，分別于6、12、24、48、72 h、7、14 d七個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死。

假手術(shù)組及模型組造模完畢后，以等量生理鹽水腹腔注射。假手術(shù)組于造模后24 h處死；模型組分別于造模后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠并取材。

1.2.4 TNF－α免疫組織化學(xué)染色 各組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死后，使用免疫組織化學(xué)染色的卵白素－生物素復(fù) 合 物 法 （avidin－biotin comeplex，ABC）制 作TNF－α的免疫染色。用10μl磷酸鹽緩沖溶液代替一抗（抗TNF－α抗體）作為陰性對照。陽性對照為已知商品化的陽性片。TNF－α定位于細(xì)胞漿，光鏡下以細(xì)胞核周邊呈棕黃色或褐色為TNF－α陽性染色。利用圖像管理系統(tǒng)在200倍視野下隨機(jī)選擇5個(gè)不重復(fù)視野，輸入Image－Pro Plus圖像處理軟件分析系統(tǒng)，記取平均灰度值。

1.2.5 凋亡相關(guān)蛋白的免疫印跡檢測 提取總蛋白，應(yīng)用BCA試劑盒定量，SDS－PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，于水平搖床室溫封閉1 h，4℃一抗孵育過夜（封閉液配一抗，此處一抗為兔抗的Caspase－3抗體1∶100／兔抗 Caspase－8抗體1∶200），室溫二抗孵育2 h（二抗為HRP－抗兔IgG抗體），ECL系統(tǒng)顯色。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件。多組間比較用方差分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 TNF－α在腦組織含量

假手術(shù)組于針道周圍可見少量TNF－α陽性表達(dá)細(xì)胞，24 h時(shí)表達(dá)量最高，7、14d未見陽性表達(dá)。模型組和藥物干預(yù)組均于6 h即可觀察到TNF－α陽性細(xì)胞，主要位于血腫周圍及同側(cè)皮質(zhì)，從形態(tài)觀察以星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞居多，也可見神經(jīng)元陽性表達(dá)；12、24 h陽性細(xì)胞數(shù)持續(xù)增加；3 d時(shí)達(dá)到高峰，范圍也明顯擴(kuò)大，于血腫周邊細(xì)胞、雙側(cè)皮質(zhì)、海馬均可見TNF－α陽性細(xì)胞；7 d時(shí)模型組陽性表達(dá)明顯減少，藥物干預(yù)組陽性表達(dá)消失；14 d時(shí)模型組、藥物干預(yù)組均未見陽性表達(dá)（表1、圖1、2）。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠TNF－α表達(dá)量的變化（±s，平均灰度值）

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠TNF－α表達(dá)量的變化（±s，平均灰度值）

注：與模型組比較，△P＜0.01

組別TNF－α表達(dá)量6 h 12 h 24 h 2 d 3 d 7 d 14 d無表達(dá) 無表達(dá)模型組 34.26＋4.37 44.56＋9.35 51.32＋10.32 56.24＋11.35 68.56＋12.64 18.37＋5.79 無表達(dá)依達(dá)拉奉干預(yù)組 10.42＋2.35△ 18.23＋4.97△ 20.35＋6.38△ 30.72＋11.46△ 35.81＋12.57△ 無表達(dá)△假手術(shù)組 1.32＋0.54 3.32＋1.24 5.56＋1.05 5.04＋1.72 1＋0.32無表達(dá)

圖1 免疫組化檢測TNF－α在腦組織中的表達(dá)水平

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠TNF－α含量的變化，與依達(dá)拉奉干預(yù)組比較，＃P＜0.01

2.2 Caspase－3免疫熒光

假手術(shù)組針道周圍細(xì)胞核數(shù)量略減少，可見少量Hoechst濃染細(xì)胞，Caspase－3表達(dá)較手術(shù)對側(cè)略增加。模型組和兩種劑量的藥物干預(yù)組均于6 h即可觀察到Hoechst濃染細(xì)胞，24 h明顯增加，72 h達(dá)高峰，之后逐漸減少，14 d時(shí)于血腫周圍仍可見少量Hoechst濃染細(xì)胞，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)模型組均較3 mg／kg藥物干預(yù)組濃染細(xì)胞量大。模型組和兩種劑量的藥物干預(yù)組6 h即可觀察到Caspase－3陽性表達(dá)，表達(dá)高峰為24 h，模型組陽性表達(dá)量均較3 mg／kg藥物干預(yù)組明顯增高（圖3）。

2.3 Caspase－3的 Western blot檢測

假手術(shù)組選擇72h，其余各組選擇6、72 h兩個(gè)時(shí)間進(jìn)行Caspase－3的 Western blot檢測。Full Caspase－3表示未經(jīng)切割的無活性酶原，分子量為35k D，Cleaved Caspase－3為切割后的活性酶，切割后分子量為17k D。半定量檢測發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組72 h未見Caspase－3激活；模型組及兩種藥物干預(yù)組均于6 h即出現(xiàn)Caspase－3激活，72 h量明顯增加；兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)激活后的Caspase－3表達(dá)量：模型組＞藥物干預(yù)組（1 mg／kg）＞藥物干預(yù)組（3 mg／kg）（圖4）。

圖3 免疫熒光檢測Caspase－3在腦組織中的表達(dá)水平

圖4 Western blot檢測腦組織中Caspase－3的激活 1、2為藥物干預(yù)組（3 mg／kg）72、6 h；3、4為藥物干預(yù)組（1 mg／kg）72、6 h；5、6為模型組72、6 h；7為假手術(shù)組72 h

2.4 血腫周邊腦組織caspase－8的表達(dá)及激活 假手術(shù)組選擇72 h，其余各組選擇24、72 h兩個(gè)時(shí)間進(jìn) 行 Caspase－8 的 Western blot 檢 測。Full Caspase－8表示未經(jīng)切割的無活性酶原，分子量為57 k D，Cleaved Caspase－8為切割后的活性酶，分子量為45 k D。半定量檢測發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組72 h未見Caspase－8激活；模型組及兩種藥物干預(yù)組于24 h可見Caspase－8激活，72 h量明顯增加；兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)激活后的Caspase－8表達(dá)量：模型組＞依達(dá)拉奉組1（1 mg／kg）＞依達(dá)拉奉組2（3 mg／kg）（圖5）。

圖5 Western blot檢測腦組織中Caspase－8的激活 1、2為藥物干預(yù)組（3 mg／kg）72、24 h；3、4為藥物干預(yù)組（1 mg／kg）72、24 h；5、6為模型組72、24 h；7為假手術(shù)組72 h

3 討 論

通常情況下腫瘤壞死因子－α（TNF－α）是由單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是繼即早基因（Immediate early gene，IEG）表達(dá)后首個(gè)增高的前炎癥因子，具有多種生物學(xué)效應(yīng)。有研究證實(shí)腦出血后TNF－α表達(dá)及分泌水平明顯升高［9］，在出血后48 h達(dá)到高峰［10］，TNF－α 表 達(dá) 量 增 加 與 凝 血 酶 有 密 切 的 關(guān)系［9］。項(xiàng)潔等發(fā)現(xiàn)TNF－α表達(dá)量與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)［11］，認(rèn)為 TNF－α的表達(dá)也是細(xì)胞凋亡觸發(fā)機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腦出血后6 h既有TNF－α的表達(dá)和分泌，72 h時(shí)表達(dá)量最高，7 d時(shí)模型組明顯減少，藥物干預(yù)組表達(dá)消失；14 d時(shí)模型組和藥物干預(yù)組均未觀察到TNF－α陽性表達(dá)。

大量研究證實(shí)，TNF－α可以通過激活死亡受體Fas／APO－1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，F(xiàn)as屬于 TNFR／NGFR家族成員，是Ⅰ型跨膜受體蛋白，分布于胸腺細(xì)胞、激活的T和B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝、脾、肺、心、腦、腸、睪丸和卵巢細(xì)胞等。Fas具有三個(gè)富含半胱氨酸的胞外區(qū)和一個(gè)稱為死亡結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)區(qū)。TNF－α與Fas結(jié)合后Fas三聚化使胞內(nèi)的DD區(qū)構(gòu)象改變，然后與接頭蛋白FADD的DD區(qū)結(jié)合，而后FADD的N端DED區(qū)就能與Caspase－8（或－10）前體蛋白結(jié)合，形成 DISC，引起caspase－8、10通過自身剪激活，它們啟動caspase的級聯(lián)反應(yīng)，使caspase－3、－6、－7激活，這幾種 Caspase可降解胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腦出血后在TNF－α表達(dá)增高的同時(shí)，Caspase－8和Caspase－3也出現(xiàn)表達(dá)量的增加，通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)模型組和藥物干預(yù)組均于6h即出現(xiàn)Caspase－3表達(dá)量增加和激活，72h表達(dá)量高于6h；兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)激活型和非激活型Caspase－3表達(dá)量模型組均高于藥物干預(yù)組。模型組和藥物干預(yù)組于24h可檢測到激活型的Caspase－8，72h表達(dá)量明顯增加；兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)激活型的Caspase－8表達(dá)量模型組均大于藥物干預(yù)組。Caspase－8激活時(shí)程和TNF－α表達(dá)時(shí)程相一致，但晚于Caspase－3的激活，說明除了TNF通路以外，還有其他上游Caspase參與激活Caspase－3，從而參與腦出血后的細(xì)胞凋亡。

1 Qureshi AI，Suri MF，Ostrow PT，et al.Apoptosis as a form of cell death in intracerebral hemorrhage.Neurosurgery，2003，52（5）：1041－1048.

2 Xue M，Del Bigio MR.Intracerebral injection of autologous whole blood in rats：time course of inflammation and cell death.Neurosci Lett，2000，283（3）：230－232.

3 Ning HAN，Su－Ju DING，Tao WU，et al.Correlation of free radical level and apoptosis after intracerebral hemorrhage in rat.Neurosci Bull，2008，24（6）：351－358.

4 李 瑋，周中和，王景周.大鼠腦出血后血腫周圍組織線粒體ATPase－6基因表達(dá)及TUNEL陽性細(xì)胞動態(tài)變化研究.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2003，20（4）：292－294.

5 Deinsberger W，Vogel J，Kuschinsky W，et al.Experimental intracerebral hemorrhage：description of a double injection model in rats.Neurol Res，1996，18（5）：475－477.

6 周中和，曲 方.一種改良大鼠自體血腦出血模型：二次注血／退針法.中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2004，12：406－408.

7 包新民，舒斯之.大鼠腦立體定位圖譜.第1版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991.39－40.

8 Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination.Stroke，1986，17（3）：472－476.

9 Hua Y，Wu J，Keep RF，et al.Tumor necrosis factor－alpha increases in the brain after intracerebral hemorrhage and thrombin stimulation.Neurosurgery，2006，58（3）：542－550.

10 Zhang X，Li H，Hu S，et al.Brain edema after intracerebral hemorrhage in rats：the role of inflammation.Neurol India，2006，54（4）：402－407.

11 項(xiàng) 潔，沈 霞，耿德勤.腫瘤壞死因子－α在大鼠腦缺血再灌注中的表達(dá)及對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響.中國臨床康復(fù)，2004，8（28）：6094－6095.