袁 靜，梁 佳，趙 頌，包翠芬*

(1遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121001;2遼寧醫(yī)學院科學實驗中心)

危重病性肌病(CIM)是危重患者肌無力和肌麻痹引起的急性原發(fā)性肌病，以骨骼肌本身或神經(jīng)—肌肉接頭間傳遞障礙為特征，主要病理變化為肌肉萎縮和壞死［1，2］。目前，CIM 的發(fā)病機制尚未明了。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)/Smad通路在調(diào)節(jié)肌細胞(尤其是骨骼肌細胞)的生長、分化中起重要作用。為探討TGF-β通路在CIM發(fā)生、發(fā)展過程中可能的調(diào)控機制，2009～2011年，我們進行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1．1 動物、儀器及試劑 健康雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～210 g，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供。全自動免疫組化染色儀(美國DAKO公司);CIAS-1000型細胞圖像分析儀(北京大恒公司);Carl Zeiss A1顯微鏡(德國公司);PowerPac 3000電泳儀、Trans-blot SD半干轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)。

地塞米松(SIGMA公司);兔抗大鼠TGF-β1、Smad3單克隆抗體(博奧森公司);細胞裂解液、蛋白質(zhì)預(yù)染marker(Beyond公司)。

1．2 方法

1．2．1 CIM模型制備及鑒定 將大鼠隨機分為正常對照組10只、觀察組30只;觀察組又分為7、9、11 d三個亞組各10只。觀察組用地塞米松5 mg/kg腹腔注射，對照組用等量生理鹽水腹腔注射，均每日1次。按照Lennon等提出的評定標準評定肌功能缺損程度。每天觀察并記錄各組肌功能缺損癥狀，不符合條件者剔除，并按嚴格的實驗條件進行補充、分組。

1．2．2 組織標本制備 各組均用4%多聚甲醛經(jīng)腹主動脈灌注固定，然后剖開左側(cè)肢體，分別在垂直于比目魚肌長軸方向處切取長約1 cm肌肉組織。繼續(xù)用4%多聚甲醛固定約12 h，然后行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、常規(guī)石蠟包埋，切片厚度5 μm。

1．2．3 免疫組化標本制備及檢測 取上述切片行常規(guī)脫蠟至水，用3%過氧化氫液處理30 min，去除內(nèi)源性過氧化物酶;采用高壓修復(fù)抗原，按順序滴加適當稀釋的一抗、二抗及SP復(fù)合物;分別行DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片，在光鏡下觀察TGF-β1、Smad3陽性表達情況。陰性對照用PBS替代一抗。采用CIAS-1000型細胞圖像分析系統(tǒng)，統(tǒng)計每個視野下TGF-β1、Smad3陽性表達的平均灰度。

1．3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS10．0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用±s表示，多組間比較用單因素方差分析。P≤0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 各組肌功能缺損情況 對照組全部存活，無肌功能缺損癥狀;觀察組死亡8只，其中觀察7 d組出現(xiàn)肌肉功能缺損癥狀7只，觀察9、11 d組均出現(xiàn)肌功能缺損癥狀，以觀察11 d組肌功能缺損程度最重。

2．2 各組肌功能缺損評分及 TGF-β1、Smad3陽性表達 見表1。

表1 各組大鼠肌功能缺損評分及TGF-β1、Smad3陽性表達比較(ˉx ± s)

3 討論

TGF-β是具有多種生物活性的多肽類細胞因子，在細胞的增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，與炎癥、纖維化、腫瘤等密切相關(guān)。Smads作為TGF-β的下游信號分子，是將TGF-β信號從細胞外轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞核內(nèi)的關(guān)鍵因子［3］。TGF-β在細胞外與TβRⅢ形成復(fù)合物后被傳遞給經(jīng)磷酸化的TβRⅡ或直接與其結(jié)合，形成二元復(fù)合物，進而激活TβRⅠ，形成三元/二元復(fù)合物，在靶細胞內(nèi)與膜受體偶聯(lián)的GS區(qū)形成信號復(fù)合物，活化Smad2/3的MH2結(jié)構(gòu)域，進而與Smad4形成異源寡聚體復(fù)合物，隨后轉(zhuǎn)移到胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。

研究表明，TGF-β/Smad通路通過調(diào)控成肌調(diào)節(jié)因子影響肌衛(wèi)星細胞增殖與分化，從而抑制骨骼肌特異基因表達［4］。近年研究顯示，衰老可引起骨骼肌萎縮，TGF-β/Smad信號通路激活是導(dǎo)致肌衛(wèi)星細胞喪失增殖修復(fù)能力的重要原因，抑制TGF-β/Smad信號通路可使衰老的骨骼肌恢復(fù)再生能力［5］。Hirose等［6］在尾部懸吊或去神經(jīng)誘導(dǎo)的肌萎縮大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，TGF-β及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體TβRII/TβRI和介導(dǎo)子Smad均出現(xiàn)不同程度的高表達。目前，由地塞米松誘導(dǎo)的CIM大鼠的TGF-β/Smad通路如何發(fā)揮作用尚無報道。我們曾觀察大鼠腹腔注射地塞米松5 mg/kg后的肌功能缺損情況，注射7 d時其出現(xiàn)肌功能缺損癥狀，光鏡下可見不同程度的肌細胞萎縮;13 d時10只大鼠分別于12、13 d死亡。本研究顯示，觀察組死亡率為26．6%(8/30);觀察7 d時 70．0%(7/10)出現(xiàn)肌功能缺損癥狀，9、11 d時均出現(xiàn)明顯肌功能缺損癥狀，且其TGF-β1、Smad3陽性表達明顯升高，以觀察11 d時最明顯。提示地塞米松誘導(dǎo)的 CIM大鼠隨病程延長，其 TGF-β1、Smad3表達升高。

［1］Meherali SM，Parpio Y，Ali TS．Critical illness myopathy［J］．J Pak Med Assoc，2010，60(11):961-963．

［2］Müllges W，Stoll G．Critical illness polyneuropathy and myopathy［J］．Dtsch Med Wochenschr，2011，136(15):769-774．

［3］Burks TN，Cohn RD．Role of TGF-β signaling in inherited and acquired myopathies［J］．Skelet Muscle，2011，1(1):19．

［4］ Li X，McFarland DC，Velleman SG．Effect of Smad3-mediated transforming growth factor-beta1 signaling on satellite cell proliferation and differentiation in chickens［J］．Poult Sci，2008，87(9):1823-1833．

［5］Carlson ME，Conboy MJ，Hsu M，et al．Relative roles of TGF-beta1 and Wnt in the systemic regulation and aging of satellite cell responses［J］．Aging Cell，2009，8(6):676-689．

［6］Hirose T，Nakazato K，Song H，et al．TGF-beta1 and TNF-alpha are involved in the transcription of type I collagen al-pha2 gene in soleus muscle atrophied by mechanical unloading［J］．J Appl Physiol，2008，104(1):170-177．