張志國，閻雪瑩，李麗霞，何 禮，丁文財，侯鐵強

微球(Microsphere)系以天然、合成或半合成高分子材料為基質(zhì)，將藥物均勻分散或包埋在骨架中而制成的球形載體給藥系統(tǒng)，屬基質(zhì)型骨架微粒。目前，以殼聚糖(Chitosan，CS)為基質(zhì)材料制備緩控釋制劑的研究己經(jīng)取得了較大進(jìn)展。芹菜素(Apigenin，AP)又稱芹黃素，是一種天然存在的黃酮類化合物，有"植物雌激素"之稱，廣泛存在于多種水果蔬菜、豆類和茶葉中，以芹菜中的含量最高，芹菜中提取的芹菜素占提取出的黃酮總量的17%［1］。芹菜素具有抗癌、抗氧化、抗炎、降血壓等多種功效［2］。但由于芹菜素不溶于水，親水性和親脂性均很差，故難以被消化道粘膜吸收，口服吸收差，大大限制了其臨床應(yīng)用。因此，本文以生物降解型殼聚糖為載體，制備芹菜素殼聚糖微球，擬在提高芹菜素生物利用度、改善口服吸收、延長藥物釋放時間，為芹菜素新劑型的研究和開發(fā)提供實驗基礎(chǔ)。

1 試驗儀器與材料

1.1 試劑與藥品 芹菜素對照品(含量≥99%)、芹菜素原料藥(含量≥98%)，購自西安小草植物科技有限公司;殼聚糖(脫乙酰度92%，青島海普生物技術(shù)有限公司);甲醇(色譜純，DIKMA公司);其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 LC-2010 AHT型高效液相色譜儀(日本島津公司);數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(HJ-6A，金壇市榮華儀器制造有限公司);Sartorius BT25S電子天平(德國 Sartorius公司);超聲波細(xì)胞破碎機(jī)(Scientz-IID，寧波新芝生物科技股份有限公司);FTIR-8400S傅立葉紅外光譜儀(日本島津有限公司);光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯 C011);JEOL JSM 6700F場發(fā)射掃描電鏡(日本電子);Mastersizer 2000激光粒度分析儀(英國馬爾文儀器有限公司);KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 分析方法的確立

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(250mm ×4.6mm，5μm);流動相:甲醇-水(60∶40);流速:1.0mL/min;檢測波長:340 nm;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:10μL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取芹菜素對照品適量，置于25mL容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，配成1 mg/mL儲備液，再分別吸取該溶液適量，用甲醇配成 1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、24.0、32.0、40.0、48.0μg/mL 的溶液，用 HPLC 法測定，記錄峰面積。以芹菜素濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程:A=55027 C+16169，r2=0.9996。結(jié)果表明，芹菜素對照品濃度在1.0～48.0μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗 精密吸取濃度為15.0μg/mL的芹菜素供試品溶液，按照“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定分析，1 d內(nèi)，每隔1 h進(jìn)樣1次，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算日內(nèi)精密度;每日測定1次，連續(xù)測定6 d，計算日間精密度。結(jié)果表明，此方法的日內(nèi)、日間精密度良好，符合含量測定的要求。

2.1.4 回收率試驗 稱取50 mg空白殼聚糖微球于10mL無水乙醇中，再量取濃度為42.0、21.0、5.25μg/mL的芹菜素?zé)o水乙醇溶液10mL，二者混合后，按“2.3”項下進(jìn)行包封率測定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算檢出濃度，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果表明，此方法的回收率為97.37% ±1.33%，符合方法學(xué)要求。

2.2 AP-CS微球的制備 采用復(fù)乳-乳化化學(xué)交聯(lián)法［3-4］制備微球。精密稱取一定量的殼聚糖細(xì)粉溶于5%的醋酸溶液8mL中，靜置使其充分溶脹除去氣泡備用，為初乳的外相;以三氯甲烷作為初乳內(nèi)相。稱取一定量的芹菜素溶解于2mL三氯甲烷中。將內(nèi)相加入外相中，置于超聲波細(xì)胞破碎機(jī)中，超聲3min后取出，逐滴加入到含4%span-80的液體石蠟40mL中。電磁攪拌器600 r/min攪拌，攪拌60min后加入交聯(lián)固化劑甲醛，固化120min。固化完成后，靜置傾去上層油相，用石油醚洗滌2次后，再用2%亞硫酸氫鈉溶液洗滌除去殘余的甲醛，異丙醇適量，洗滌2次，抽濾，干燥，即得AP-CS微球。

2.3 微球載藥量及包封率的測定 采用研磨-超聲法［5］對AP-CS微球進(jìn)行包封率和載藥量的測定。將AP-CS微球50 mg于研缽中研磨成粉末，加入10mL無水乙醇繼續(xù)研磨至溶液顯土黃色，置于錐形瓶中超聲30min，靜置一段時間后，精密吸取上清液1mL，用無水乙醇定容至10mL，用0.22μm微孔濾膜濾過，注入液相色譜儀。計算微球中藥物的包封率和載藥量［載藥量(%)=微球中的藥物量/微球重量×100%;包封率(%)=微球中的藥物量/投藥量×100%］。微球經(jīng)過處理后，通過顯微鏡觀察，微球在外力作用下已經(jīng)被研碎，藥物可溶于無水乙醇溶劑中。因此，研磨-超聲法測定微球中藥物包封率方法可行。

2.4 正交試驗設(shè)計 在AP-CS微球的制備過程中，本文選取了影響微球載藥量和包封率較顯著的4個因素作為考察對象，即藥物與殼聚糖的比例(A)、殼聚糖濃度(B)、乳化劑 span-80濃度(C)、固化劑甲醛用量(D)，每個因素選取3個水平，以載藥量、包封率為指標(biāo)，通過L9(34)正交試驗設(shè)計優(yōu)選最佳工藝條件，進(jìn)行評價。見表1。

表1 實驗影響因素和水平(n=3)

按照L9(34)試驗設(shè)計，共進(jìn)行了9組試驗，每組3個平行樣，并進(jìn)行綜合加權(quán)分析。微球平均載藥量x、平均包封率y均是越高越好，這里規(guī)定微球載藥量x=8.5%為滿分(100分)，X表示微球載藥量得分，用公式X=x/8.5×100，把各試驗號的微球載藥量轉(zhuǎn)化為分?jǐn)?shù);規(guī)定微球包封率y為73%為滿分(100分)，Y表示微球包封率得分，用公式Y(jié)=y/73×100，把各試驗號的微球包封率轉(zhuǎn)化為分?jǐn)?shù)。載藥量和包封率的權(quán)重系數(shù)均為0.5，按公式Z=0.5 X+0.5 Y，計算綜合得分。見表2。

2.5 工藝條件的選擇 實驗設(shè)計的A、B、C、D因素均影響微球的包封率和載藥量，分析結(jié)果表明，各因素對載藥量、包封率的影響程度:A＞B＞D＞C，即藥物與載體比例＞殼聚糖濃度＞固化劑甲醛用量＞乳化劑span-80用量，由于C為不顯著因素，但對微球粒徑影響較大，雖然隨著乳化劑濃度C濃度增大粒徑減小，但是加入過高電磁攪拌器攪拌困難，綜合考慮，乳化劑span-80濃度確定為C2。最終確定最優(yōu)水平:A1B1C2D2。

按最佳工藝，即藥物與殼聚糖的比例為1∶5，殼聚糖濃度為15 mg/mL，乳化劑span-80的濃度為4.5%，固化劑甲醛用量為1.8mL。制備4批微球，平均包封率為 69.69%，平均載藥量為8.54%。

2.6 微球形態(tài)、粒度分布及紅外光譜考察 按最佳工藝制得的微球，在光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)，AP-CS微球呈圓形，邊界清晰，表面略顯粗糙，不粘連或極少粘連，見圖1;在場發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察，AP-CS微球呈圓球形，粒徑較均勻，表面較光滑，較少粘連，見圖2;激光粒度分析儀測定粒徑分布的結(jié)果表明，微球的平均粒徑為84.33μm，粒徑分布呈正態(tài)分布，90%以上微球的粒徑為50.0～110.0μm。

表2 正交試驗結(jié)果及方差分析

表3 正交試驗方差分析

紅外光譜結(jié)果表明，AP、AP與空白微球的物理混合物在1223 cm－1處均出現(xiàn)C-O-C官能團(tuán)伸縮振動吸收峰，在1650 cm－1處均出現(xiàn)了-C=O官能團(tuán)伸縮振動吸收峰，但是在含藥微球中，這兩處峰都出現(xiàn)減弱及寬化，且在其他位置上，與物理混合物有顯著性差異，表明AP-CS制備成功。

圖1 AP-CS微球顯微鏡照片(×40倍)

圖2 AP-CS微球的掃描電子顯微鏡照片

2.7 微球體外藥物釋放 芹菜素殼聚糖微球體外釋藥采用直接釋藥法測定。筆者考察了pH 6.8和pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液對AP-CS微球釋藥的影響。分別稱取AP-CS微球約30 mg(含芹菜素約2 mg)，置于盛有100mL pH 6.8、pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液的燒杯中，于電磁攪拌器(37±1)℃中，以75 r/min轉(zhuǎn)動。定時取釋放液2mL，同時補加等量釋放介質(zhì)。釋放液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液于檢測波長處測定，以累積釋藥率對時間做圖，釋放率計算公式如下:

式中Ct為各時間點測得釋放介質(zhì)中的芹菜素濃度(μg/mL)，W為投入微球劑型中芹菜素的總重量(μg)，V0為釋放介質(zhì)的總體積，V為每次取樣體積。計算微球的累積釋放百分率，見圖3。

圖3 芹菜素殼聚糖微球的體外累積釋藥曲線

結(jié)果表明，AP-CS微球在pH 6.8、pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液中36 h的累計釋放量分別達(dá)70.25%與74.14%，說明本實驗制得的微球制劑具有一定的緩釋作用。

根據(jù)《中國藥典》2010版附錄中微囊、微球與脂質(zhì)體制劑的指導(dǎo)原則，開始0.5 h內(nèi)的釋放量要求低于40%。本試驗制得的微球在0.5 h內(nèi)藥物釋放量低于10%，符合藥典要求。

2.8 微球釋藥曲線的擬合 按優(yōu)化處方和工藝制備的芹菜素殼聚糖微球釋藥結(jié)果分別以零級動力學(xué)方程、一級動力學(xué)方程、Higuchi方程進(jìn)行擬合，以擬合優(yōu)度(r)對方程擬合度加以判斷，得到擬合方程，見表4。

表4 芹菜素殼聚糖微球不同釋藥模型擬合方程

由表4可見，芹菜素殼聚糖微球在不同pH值的釋放液中，釋放模型擬合接近程度依次為:Higuchi模型＞一級動力學(xué)模型＞零級動力學(xué)模型。

3 討論

3.1 預(yù)實驗中，筆者采用了實驗室常用的乳化-化學(xué)交聯(lián)法，僅獲得了包封率為30.5%的微球。本文采用的復(fù)乳-乳化化學(xué)交聯(lián)法是在乳化-化學(xué)交聯(lián)法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，更適合于芹菜素類疏水性藥物。結(jié)果表明，微球形態(tài)良好，具有較高的包封率和載藥量，符合微球制劑的粉體學(xué)要求。方法重現(xiàn)性好，簡單、可行。

3.2 微球的藥物測定方法種類較多，包括酸回流法、雙氧水氧化法、超聲粉碎法及溶菌酶等。本實驗采用復(fù)乳-乳化化學(xué)交聯(lián)法制備微球，殼聚糖分子2位游離氨基與甲醛通過氨醛縮合反應(yīng)形成鍵橋，使微球固化，殼聚糖降解性發(fā)生變化。制備的微球不能被溶菌酶降解，也不能用硫酸、高氯酸消解。由于芹菜素在無水乙醇中具有一定的溶解度，因此，參考相關(guān)文獻(xiàn)，通過物理方法(研磨-超聲法)，取得了較好的結(jié)果，且該方法簡單、可靠、省時。

3.3 殼聚糖是一種高分子載體材料，相同相對分子質(zhì)量下，脫乙酰度越高，溶液黏度越低。本實驗選擇了脫乙酰度92%、相對分子質(zhì)量10萬的殼聚糖，是為了在相同黏度下提高殼聚糖的濃度，增加氨醛縮合反應(yīng)的氨基數(shù)，使得生成的微球骨架更致密。殼聚糖粘度大，制備的微球易粘連，本實驗采用加大外油相體積的方法，較好地解決了微球粘連問題。

3.4 體外釋放度實驗是常用的微球制劑體外釋藥速度評價方法，文獻(xiàn)中應(yīng)用較多的方法有直接釋藥法和透析法。筆者對影響AP-CS微球體外釋放度的方法進(jìn)行了考察，預(yù)實驗結(jié)果表明，采用透析法微球的24 h累積釋藥僅為10%。分析可能有兩個原因:①殼聚糖分子量大，堵塞透析袋，影響藥物的釋放;②制劑是固態(tài)粉末，易沉積于透析袋底部，直接影響制劑與釋放介質(zhì)的接觸面積。而采用直接釋藥法，將制備的微球直接投入釋放介質(zhì)中測定，釋放效果較好。

［1］Crozier A，Lean MEJ，McDonald MS，et al.Quantitative analysis of the flavonoid content of commercial tomatoes，onions，lettuce，and celery［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1997，45(3):590-595.

［2］隋海霞，徐海濱，蔭士安.芹菜素的生物學(xué)作用［J］.國外醫(yī)學(xué):衛(wèi)生學(xué)分冊，2008，35:103-107.

［3］Pavanetto F，Perugini P，Conti B.Evaluation of process parameters involved in chitosan microsphere preparation by the o/w/o multiple emulsion method［J］.Journal of Microencapsulation，1996，13(6):679.

［4］敦潔寧，鄧樹海，苗彩云，等.大蒜素殼聚糖微球的研究［J］.山東大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2005，43(5):452-454.

［5］李可欣，陳大為.RP-HPLC法測定殼聚糖微球中5-氟尿嘧啶的包封率［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2005，11(6):434-437.