曾振東 韋金育 曾翠瓊 楊增艷 陳 術(shù)

廣西民族醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530001

蛞蝓治癌來(lái)之民間經(jīng)驗(yàn)，近年有關(guān)蛞蝓對(duì)肺癌的臨床與實(shí)驗(yàn)報(bào)告表明其對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)確有一定抑制作用，［1－2］但其作用機(jī)理還不太清楚。本研究將通過蛞蝓提取物對(duì)人肺癌細(xì)胞凋亡的體外實(shí)驗(yàn)，探討其抗癌作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

流式細(xì)胞儀為美國(guó)Backman coulter Epics XL型;Annexin V－FITC測(cè)定試劑盒為美國(guó)Backman公司產(chǎn)品。

1.2 蛞蝓提取物

實(shí)驗(yàn)用蛞蝓采自南寧市郊區(qū)農(nóng)村，經(jīng)處理后用乙酸乙酯提取，冰箱保存?zhèn)溆?。蛞蝓原?dòng)物經(jīng)廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院專家鑒定為腹足綱蛞蝓科野蛞蝓。

蛞蝓提取物的制備:稱取藥物49.53g，加入乙酸乙酯150ml，80℃回流1h，抽濾，殘?jiān)貜?fù)回流一次，合并濾液，減壓干燥，濃縮成浸膏樣備用。用時(shí)1mg先用100uL甲基亞砜 (DMSO)溶解。加入900uL小牛血清培養(yǎng)液，配制成1mg/ml的工作液，即成本實(shí)驗(yàn)所用藥液。對(duì)照組加入10%DMSO培養(yǎng)液。

1.3 細(xì)胞株及其培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞株A549由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

細(xì)胞培養(yǎng)A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清、100kU/L青霉素和100mg/L鏈霉素的RPM1－1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 流式細(xì)胞光度術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

(1)蛞蝓提取物處理的肺癌細(xì)胞和空白細(xì)胞，胰酶消化，吹打，移至離心管中1000rpm，離心5min。 (2)棄上清，拍打，加PBS 2ml，混勻后再離心1000rpm離心5min棄上清。(3)拍打細(xì)胞加Binding Buffer 500μl調(diào)整細(xì)胞濃度約為5x106cell/ml，置冰盒上。(4)取100μl樣本至試管中，加Annexin V－FITC 5μl，PI 2.5μl.反應(yīng)10min。(5)加450μl Binding Buffer.流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，以分析靶細(xì)胞磷脂酰絲氨酸外化率。

2 結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)合分析表明 (見圖1)，肺癌細(xì)胞A549與不同濃度藥物共同孵育24小時(shí)后，靶細(xì)胞的磷脂酰絲氨酸 (PS)，由細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到膜外，即出現(xiàn)PS外化。給藥組的PS外化率 (即凋亡細(xì)胞數(shù))高于空白對(duì)照組。不同濃度的藥物對(duì)細(xì)胞的影響各不相同，細(xì)胞凋亡率與藥物濃度成正相關(guān)。見表1。

表1 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞不同轉(zhuǎn)歸的百分比 (%)

4 討論

蛞蝓提取物可以抑制人體內(nèi)外腫瘤的生長(zhǎng)，且無(wú)明顯毒副作用，是近年受人們關(guān)注的抗癌動(dòng)物藥。但目前對(duì)蛞蝓抗癌的作用機(jī)制還不太了解。為了解蛞蝓抗癌機(jī)理，我們用蛞蝓提取物對(duì)人肺癌細(xì)胞凋亡的影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。我們通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明蛞蝓提取物能誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡，其凋亡率達(dá)5.3～15.1%，細(xì)胞凋亡率與藥物濃度成正相關(guān)。研究結(jié)果提示，蛞蝓提取物對(duì)人肺癌細(xì)胞A549具有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)由基因決定的自動(dòng)結(jié)束細(xì)胞生命的過程。有專家認(rèn)為惡性腫瘤是由于細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡兩種作用相反的生命活動(dòng)間失去了平衡，表現(xiàn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)而形成的，因而細(xì)胞凋亡異常是腫瘤形成和發(fā)展的一個(gè)重要原因。［3～5］通過各種途徑和方式誘導(dǎo)、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的凋亡有可能是抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素，值得進(jìn)一步探討。

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