劉 穎 陳 東 劉佳梅 薛 輝

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，吉林 長春 130021)

由于惡性腦膠質(zhì)瘤在腦組織中的廣泛浸潤特性，使現(xiàn)有的手術(shù)及輔助性放療、化療的療效不能令人滿意，也限制了基因治療載體的應(yīng)用。為此，應(yīng)用具有遷移能力的細(xì)胞作為基因治療的載體有希望成為顱內(nèi)膠質(zhì)瘤治療的有效手段。已有實(shí)驗(yàn)表明，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)可遷移到腦腫瘤和腦缺血等部位〔1〕，但具體機(jī)制還不是十分清楚。趨化因子(CXC)及其受體(CXCR4)和其配體基質(zhì)細(xì)胞因子-1(SDF-1)在BMSCs向C6膠質(zhì)瘤遷移的作用，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本文通過CXCR4和 SDF-1在 BMSCs和 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)，探討B(tài)MSCs向C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 BMSCs分離培養(yǎng) 無菌條件下取出Wistar大鼠(由本校實(shí)驗(yàn)動物中心提供，體重約200 g)股骨，用注射器吸取無鈣鎂的Hank液，沖出骨髓，反復(fù)吹打，用比重1.073的percoll分離，經(jīng)Hank液洗后，用10%胎牛血清(FCS)的IMDM重懸細(xì)胞，以1×108/ml細(xì)胞密度種植于培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3天換液，以后每3 d換液1次，直至細(xì)胞融合達(dá)90%。對接近融合的細(xì)胞用0.25%胰酶孵育消化2～3 min，以1∶2的比例傳代培養(yǎng)。

1.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 將BMSCs、小鼠(NIH3T3)細(xì)胞和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別接種于35 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長至70%～80%時，行常規(guī)免疫組織化學(xué)方法處理，BMSCs和NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行CXCR4染色，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行CXCR4和SDF-1染色。小鼠抗大鼠CXCR4抗體和SDF-1抗體均購自美國Santa cruz公司。二抗購自福州邁新公司。

1.3 BMSCs體外遷移 實(shí)驗(yàn)分NIH3T3細(xì)胞對照組和BMSCs實(shí)驗(yàn)組。先將Matrigel放入4℃冰箱中過夜，使其溶解;將Matrigel用不含血清的IMDM培養(yǎng)基1∶1稀釋;加60μl稀釋后的Matrigel于Transwell小室的聚碳酯膜上，37℃溫箱30 min，使Matrigel聚合成凝膠;收集 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度為105/ml，取100μl加入下室;補(bǔ)基礎(chǔ)培養(yǎng)液至600μl;分別收集BMSCs和NIH3T3細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為105/ml，取100μl加入上室;24 h后，取出小室，用棉簽擦去膜上面未穿過膜的細(xì)胞。

1.4 BMSCs在荷瘤鼠腦內(nèi)的遷移 ①Wistar大鼠5只(由本校實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，平均體重260～300 g，大鼠膠質(zhì)瘤模型建立見文獻(xiàn)〔2〕。蘇木素-伊紅(HE)染色，沖洗后，于倒置相差顯微鏡下(200×)觀察穿過膜的細(xì)胞數(shù)。每個膜中央部分和周圍部分各隨機(jī)取3個視野，計(jì)數(shù)每個視野內(nèi)的穿過微孔的細(xì)胞數(shù)。每組3個平行孔。②在BMSCs移植前，將Hoechst33342加入培養(yǎng)基中(終濃度為5μg/ml)，48 h后，0.25%胰蛋白酶消化后，離心收集細(xì)胞，用生理鹽水制細(xì)胞懸液備用。Hoechst33342標(biāo)記的BMSCs呈藍(lán)色。③C6膠質(zhì)瘤接種3 d后，分別于5只荷瘤鼠對側(cè)大腦注射106個BMSCs。Wistar大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 ml/kg)后，固定于立體定位儀上。用磷酸鹽緩沖液(PBS)調(diào)整細(xì)胞濃度為108/ml，用微量注射器抽取5μl標(biāo)記的BMSCs懸液。注射位點(diǎn)見文獻(xiàn)〔2〕。④BMSCs移植21 d后，取腦冠狀切面制作冰凍切片，切片厚10μm。用Olympus熒光顯微鏡直接觀察細(xì)胞的遷移和存活。同時進(jìn)行CXCR4和SDF-1常規(guī)免疫組織化學(xué)染色。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，首次換液，去除未貼壁細(xì)胞。原代培養(yǎng)3 d時，貼壁細(xì)胞呈球形、多角形、梭形，細(xì)胞較小，細(xì)胞之間比較稀疏。原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長緩慢，呈克隆狀生長，培養(yǎng)2 w后，細(xì)胞達(dá)到融合。有一些小圓形細(xì)胞，傳代后可被去除。傳代后，大而扁平狀細(xì)胞逐漸增多，但隨著細(xì)胞分裂生長，細(xì)胞密度增大，細(xì)胞匯流處的BMSCs形態(tài)較均一，為長梭形，呈旋渦狀或平行生長，折光性較強(qiáng)。傳代后的細(xì)胞生長速度比原代細(xì)胞快，一般7 d即可傳代。

2.2 BMSCs、NIH3T3細(xì)胞和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞CXCR4和SDF-1的表達(dá) 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果表明，少數(shù)BMSCs表達(dá)CXCR4，陽性率為0.86%;NIH3T3細(xì)胞不表達(dá)CXCR4;C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)CXCR4和 SDF-1，陽性率分別為 63.53%和 48.42%。見圖1。

2.3 BMSCs體外遷移實(shí)驗(yàn) 體外遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，24 h后，可見NIH3T3細(xì)胞和 BMSCs向下層C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移，BMSCs遷移的細(xì)胞數(shù)顯著多于NIH3T3細(xì)胞。

2.4 BMSCs在大鼠腦內(nèi)的遷移

圖1 BMSCs和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞CXCR4和SDF-1表達(dá)的免疫組化結(jié)果

圖2 腫瘤組織和正常腦組織CXCR4和SDF-1表達(dá)的免疫組化結(jié)果(標(biāo)尺示20μm)

2.4.1 腫瘤組織CXCR4和SDF-1的表達(dá) 免疫組織化學(xué)檢測腫瘤組織CXCR4和SDF-1表達(dá)均呈強(qiáng)陽性。對側(cè)正常腦組織僅有少數(shù)細(xì)胞為CXCR4和SDF-1陽性。見圖2。

2.4.2 BMSCs向膠質(zhì)瘤遷移 BMSCs移植21 d后，熒光顯微鏡下觀察到BMSCs廣泛分布于周圍的胼胝體、皮層和血管。見圖3。

圖3 BMSCs移植21 d后廣泛分布于胼胝體(標(biāo)尺示20μm)

3 討論

目前手術(shù)加放化療是惡性膠質(zhì)瘤的主要治療方法，但臨床效果并不令人滿意，這主要是由于部分腫瘤細(xì)胞能夠擴(kuò)散浸潤，并廣泛遷移至正常腦組織，這些浸潤病灶常常遠(yuǎn)離原發(fā)病灶，形成所謂“衛(wèi)星病灶”，逃避常規(guī)的治療成為膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的主要原因。如何有效地治療浸潤病灶，是治療膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵。BMSCs屬于多能干細(xì)胞，其在不同條件下可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞〔3〕。BMSCs可以來源于患者自體，從而避免了免疫排斥反應(yīng)。BMSCs移植后能在宿主體內(nèi)長期存活和分化，穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)源性或外源性基因，發(fā)揮治療作用，同時與宿主整合，發(fā)揮修補(bǔ)作用。BMSCs的主動遷移性更補(bǔ)充了常規(guī)治療方法不能達(dá)到的遠(yuǎn)距離治療能力。到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)移植入腦內(nèi)的BMSCs具有致瘤性，臨床應(yīng)用是較為安全的。因此，研究者希望能夠用BMSCs作為基因治療腫瘤的載體。BMSCs可主動遷移到腫瘤部位已被證實(shí)，但對其遷移機(jī)制知之甚少。CXC趨化因子受體CXCR4是一種G蛋白耦聯(lián)的具有7個跨膜亞單位的受體，SDF-1是其唯一配體。最早研究發(fā)現(xiàn)CXCR4表達(dá)在T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中，能夠介導(dǎo)這些細(xì)胞的趨化作用。大量實(shí)驗(yàn)證明，在器官損傷時，骨髓中的CXCR4陽性BMSCs被動員釋放到外周血，并通過SDF-1的趨化作用到達(dá)損傷的組織〔4，5〕。BMSCs中約1%的細(xì)胞表達(dá)CXCR4，但對BMSCs的遷移非常重要。研究證明在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中SDF-1和CXCR4共同存在，并且隨著腫瘤惡性程度的增高表達(dá)都增加。

本結(jié)果說明BMSCs向C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移與CXCR4和SDF-1有一定的關(guān)系。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤模型鼠健側(cè)大腦注射BMSCs，移植21 d后，不但BMSCs在腦內(nèi)可存活較長時間，而且可見到BMSCs沿著胼胝體、腦室和血管向?qū)?cè)腫瘤組織遷移。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤CXCR4和SDF-1表達(dá)呈強(qiáng)陽性。健側(cè)正常大腦組織雖有CXCR4和SDF-1表達(dá)，但顯著少于患側(cè)腫瘤組織。BMSCs向膠質(zhì)瘤遷移機(jī)制是相當(dāng)復(fù)雜的。除了與CXCR4/SDF-1通路有關(guān)外，還可能是由于腫瘤細(xì)胞分泌的可溶性因子〔如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板衍生因子(PDGF)和白細(xì)胞介素(IL-8)等〕〔6〕和 BMSCs分泌的黏附分子(如CD44等)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)證明膠質(zhì)瘤細(xì)胞對BMSCs具有明顯的趨化作用，可能與膠質(zhì)瘤細(xì)胞高表達(dá)CXCR4和SDF-1有關(guān)，且BMSCs在體內(nèi)可長期生存，沒有免疫排斥反應(yīng)，這一結(jié)果為以BMSCs為細(xì)胞載體的靶向治療膠質(zhì)瘤提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 Deng W，Han Q，Liao RC，et al.Long-term distribution of adult stem cells in different tissues after transplantation〔J〕.Stem Cell Cell Ther，2003;1:62-5.

2 劉 穎，陳 東，李菁華.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化及在成年膠質(zhì)瘤大鼠腦內(nèi)的遷移〔J〕.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2007;23(6):626-30.

3 Herzog EL，Chai L，Krause DS.Plasticity of marrow-derived stem cells〔J〕.Blood，2003;102(10):3483-93.

4 Ma J，Ge J，Zhang S，et al.Time course of myocardial stromal cell-derived factor 1 expression and beneficial effects of intravenously administered bone marrow stem cells in rats with experimental myocardial infarction〔J〕.Basic Res Cardiol，2005;100(3):217-23.

5 Ratajczak MZ，Kucia M，Reca R，et al.Stem cell plasticity revisited:CXCR4-positive cells expressing mRNA for early muscle，liver and neural cells“hide out”in the bone marrow〔J〕.Leukemia，2004;18:29-40.

6 Vogel W，Grunebach F，Messam CM，et al.Heterogeneity among human bone marrow derived mesenchymal stem cells and neural progenitor cells〔J〕.Haematologica，2003;88:126-33.