楊 帆，錢 寧，戴 欣，彭 俊

（松遼流域水資源保護局，吉林 長春130021）

近年來環(huán)境污染和富營養(yǎng)化程度不斷加劇，藍藻水華頻繁發(fā)生，這已經(jīng)成為國內(nèi)外普遍關(guān)注的問題。微囊藻毒素即為水體中藍藻類如銅綠微囊藻、魚腥藻和念珠藻等藻屬水華釋放一類具有強烈致癌、具有肝毒性的單環(huán)七肽化合物，它的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)可表示為：環(huán)D-丙氨酸-L-X-赤-β-甲基-D-異天冬氨酸-L-Y-Adda-D-異谷氨酸-N-甲基脫氫丙氨酸。其中Adda是表達MC活性的必需基因，其結(jié)構(gòu)改變或被去除，毒素的毒性都會降低。X，Y為2個可變的L-氨基酸。由于X，Y的不同而產(chǎn)生多種異構(gòu)體，目前已知有60多種。其中存在最普遍、含量較多、毒性較大的是MCLR，MC-RR和MC-YR(L，R，Y分別代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸)。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 1200 series-Agilent 6310 Ion Trap MS液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀；Caliper Life Scienes全自動固相萃取裝置；ISOLUTE C18（EC）固相萃取柱（200 mg，3 mL）；OA-SYSTM 氮吹裝置；電子天平（0.0001 g）；KD-濃縮瓶；濾膜（0.45 μm GF/C玻璃纖維濾膜）；過濾頭。甲醇、甲酸均為Burdick&Jackson色譜純；水為wahaha純凈水；微囊藻毒素標準樣品10 mg/L。

1.2 樣品前處理

1.2.1 樣品制備

用0.45 μm GF/C玻璃纖維濾膜過濾水樣，用少量甲醇清洗濾膜。

1.2.2 樣品的富集和洗脫

設(shè)置10 ml甲醇和10 ml高純水，用流速為1 ml/min活化固相萃取柱。取1000 ml水樣濾液（1.2.1）以及空白和加標樣品，以10 ml/min的流速通過全自動固相萃取裝置進行富集。當所有樣品通過萃取柱后，用高純氮氣吹5 min，再用10 ml20%甲醇淋洗液淋洗固相萃取柱。最后用10 ml100%甲醇洗脫富集在柱上的微囊藻毒素，將洗脫液收集在KD-濃縮瓶內(nèi)。

1.2.3 富集濃縮

將KD-濃縮瓶放在40℃的水浴上，用氮氣吹脫濃縮至0.5 ml，用甲醇定容至1 ml，經(jīng)過濾頭轉(zhuǎn)移至樣品瓶。

1.3 色譜條件

Agilent 1200 Series液相色譜，色譜柱ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）,柱溫20℃，流動相為甲醇和0.1%（體積分數(shù)）甲酸水溶液，流速為0.3 ml/min，梯度洗脫為5.0 min內(nèi)甲醇的體積分數(shù)從40%升至100%，保持12 min；進樣量為10 ul。

1.4 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜工作條件見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗條件優(yōu)化

2.1.1 流動相選擇

相關(guān)的標準方法以及文獻中對于水中微囊藻毒素(MC-LR)的分析多為液相色譜法，使用乙腈和磷酸鹽作為流動相，通過紫外檢測器檢測，乙腈毒性大、成本高，而且磷酸鹽容易堵塞色譜柱，影響離子化效率，污染離子源。這里選擇甲醇和水作為流動相進行梯度洗脫，并且考慮到酸性環(huán)境可以保證MC-LR的離子化效率，故在水中加入0.1%甲酸，這樣可以降低分析成本，保護色譜柱和離子源，并且減少了實驗過程中對操作人員的危害。

表1 質(zhì)譜工作條件表

2.1.2 離子模式選擇

其它條件相同時，改變離子模式采集總離子流圖，比較正負模式提取離子流圖（EIC），正模式的響應(yīng)值明顯高于負模式，所以選擇正模式。見圖1。

圖1 正模式和負模式提取離子比較圖

2.1.3 其它質(zhì)譜條件選擇

毛細管出口電壓和錐孔電壓影響離子的傳輸效率和離子阱的捕集效率，控制這兩個電壓可以方便地控制碰撞能量，從而得到不同豐度的碎片離子。當毛細管出口電壓和錐孔電壓過大時，傳輸效率高，但是會在傳輸過程中發(fā)生傳輸區(qū)的碰撞誘導(dǎo)解離，這里發(fā)生的碰撞誘導(dǎo)解離會使母離子破碎；過小會減低母離子傳輸效率。利用儀器優(yōu)化參數(shù)調(diào)整功能，通過針泵把濃度為0.6 mg/L的MC-LR樣品直接注入離子源，使用毛細管出口電壓和錐孔電壓優(yōu)化程序，得到最優(yōu)的毛細管出口電壓165.7 V和錐孔電壓40.00 V。

本方法采用多反應(yīng)監(jiān)測模式進行微囊藻毒素的定量分析。選擇合適的母離子和子離子是保證目標化合物獲得最佳靈敏度的重要因素，通過目標化合物的一級質(zhì)譜圖選擇相對較大的特征離子作為母離子，可以得到更高的靈敏度。MC-LR的分子式為C49H74N10O12，在一級譜圖中主要得到[M+H]+的母離子碎片。選定996 m/z作為母離子進入離子阱在碰撞誘導(dǎo)解離作用下，產(chǎn)生不同子離子碎片。當碰撞能量過大時阱中能量高，離子易碎裂，但也使碎片離子更易出阱；相反能量過低時，離子在阱中相對穩(wěn)定，母離子不易打碎，產(chǎn)生子離子碎片過少。根據(jù)以上原因，觀察不同能量二級質(zhì)譜圖產(chǎn)生的碎片離子，選擇0.9 V，此時可以保證獲得最佳靈敏度。圖2為不同碰撞電壓下的二級質(zhì)譜圖。選擇定量離子553，599，978 m/z，對其加合進行定量，見圖3。

2.2 線性、檢出限和回收率試驗

圖2 不同碰撞電壓下的二級質(zhì)譜

精密稱取MC-LR10.0 mg/L的標準溶液，逐級將其稀釋成 0.600，0.200，0.10，0.050 mg/L 的濃度。在上述檢測條件下測定，以峰面積對應(yīng)不同濃度進行線性回歸計算，回歸方程為y=-12235+3729 476x，相關(guān)系數(shù) r=0.999。

按照信噪比（S/N≥10）作為定量限進行試驗，得到該化合物MC-LR的定量限為0.01 mg/L，對1000 ml水樣富集濃縮到1 ml，該方法定量限為0.00001 mg/L，能夠滿足地表水環(huán)境質(zhì)量標準GB3838-2002和生活飲用水GB/T5749-2006 MCLR的控制標準限值0.001 mg/l，并且優(yōu)于國標方法檢測限30倍。

取同一水樣1000 ml為本底，分別加入0.100和0.060 μgMC-LR的標準溶液，按照1.2的步驟對該加標樣品進行前處理，并分析測定。對其結(jié)果進行計算得出回收率分別為91.26%和70.53%。

2.3 實際樣品分析

對2009年6月遼河流域省界斷面福德店東、福德店西、王奔、兩家子和后義和進行含量檢測，結(jié)果均未檢出微囊藻毒素，低于地表水控制標準。

3 結(jié)論

圖3 MC-LR的MS(2)

本實驗利用全自動固相萃取裝置對樣品進行富集、濃縮，選擇甲醇-水作為流動相，使用液相色譜-離子阱質(zhì)譜，建立MC-LR的多反應(yīng)監(jiān)測的檢測方法。該方法降低了背景噪音、靈敏度高、選擇性好，回收率高且穩(wěn)定，線性關(guān)系（r=0.999）和回收率（71%～91%）等方法學(xué)指標較好，檢出限能完全滿足我國地表水環(huán)境質(zhì)量標準生活飲用水的控制標準。此方法用于遼河流域省界斷面水樣的檢測，在5個水樣中MC-LR均未檢出。

［1］殷麗紅.微囊藻毒素致肝癌研究進展［M］.國外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊，2005，32(3)：170-174.

［2］王 靜，龐曉露，劉錚錚，侯鏡德.超高效液相色譜／串聯(lián)質(zhì)譜法分析水中的微囊藻毒素［J］色譜.2006：335—338.

［3］BARCO M,FLORES C,RIVERA J,et al.Determination of microcystin variants and related peptides present in a water bloom of Planktothrix(Oscillatoria)rubescens in a Spanish drinking water reservoir by LC／ESI—MS［J］.Toxicon，2004,44(8)：881-886.