邵金華，朱智勇，劉 歡，鄧 佳，歐陽(yáng)青，李軍艷

（湖南科技學(xué)院，湖南 永州 425100）

β-葡聚糖酶是一類能降解谷物中β-葡聚糖的水解酶類的總稱，包括1，3-1，4-β-葡聚糖酶、1，3-β-葡聚糖酶、1，2-1，4-β-葡聚糖酶、1，4-β-葡聚糖酶和1，3-1，6-β-葡聚糖酶，均屬于半纖維素酶類[1]。β-葡聚糖酶能降解β-葡聚糖分子中的β-1，3和β-1，4糖苷鏈，使之降解為小分子的還原糖和寡糖，失去親水性和粘性。隨著人們對(duì)β-葡聚糖酶的深入研究，β-葡聚糖酶在食品、釀造、飼料和日化等工業(yè)方面應(yīng)用價(jià)值正逐漸地顯現(xiàn)出來(lái)[2]。β-葡聚糖酶作為一種新型添加劑，具有廣泛而顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，開(kāi)發(fā)前景十分廣闊[3]。筆者對(duì)β-葡聚糖酶進(jìn)行了深入的生物學(xué)研究，旨在篩選出能產(chǎn)生適應(yīng)不同應(yīng)用目標(biāo)的β-葡聚糖酶的野生菌株，為今后生產(chǎn)出活力高、穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土樣 采自湖南省永州市陽(yáng)明山、菜地、路邊、西山等地，取其3～10 cm深層土壤。

1.1.2 試 劑 標(biāo)準(zhǔn)大麥β-葡聚糖購(gòu)自Sigma公司；β-葡聚糖，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，純度99.9%；其他試劑均為AR級(jí)或BR級(jí)商品試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）基本培養(yǎng)基（g/l00 mL）：蛋白胨 1.0，牛肉膏0.4，瓊脂 1.8，NaCl 0.4，pH值7.2,121℃滅菌25 min。（2）分離培養(yǎng)基（g/l00 mL）：大麥β-葡聚糖 0.2，剛果紅 0.004，瓊脂 1.8，KNO30.1，NaH2PO40.12，MgSO40.03，CaCO30.01，pH 值 7.2，121℃滅菌25 min。（3）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/l00 mL）：大麥粉 4.0，玉米粉 3.0，豆餅粉 3.0，KH2PO40.002，Mg－SO40.02，CaCO30.05，pH 值 7.1，121℃滅菌 25 min。（4）PDA 培養(yǎng)基（g/l00 mL）：馬鈴薯（去皮）20.0，蔗糖（或葡萄糖）2.0，瓊脂2，水100 mL，pH值自然，121℃滅菌 25 min。

1.2 方法

1.2.1 菌種初步篩選 （1）樣品的采集與處理：在永州市陽(yáng)明山、菜地、路邊、西山等不同地點(diǎn)共采集了46個(gè)土樣，經(jīng)去雜、風(fēng)干裝入已滅菌的牛皮紙袋內(nèi)，封好袋口，備用。（2）富集培養(yǎng)：稱取處理過(guò)的土樣l g，加入裝有50 mL已滅菌的富集培養(yǎng)基中的三角瓶中，30℃恒溫培養(yǎng)48 h，每4 h搖勻1次，每個(gè)土樣做3個(gè)平行。富集培養(yǎng)48 h后進(jìn)行平板分離。（3）菌種分離：將富集培養(yǎng)物用無(wú)菌生理鹽水稀釋成 10-2～10-7六個(gè)梯度，選擇 10-4，10-5，10-6三個(gè)梯度試管菌種，用滅菌的移液管取0.5 mL，涂布接種到以β-葡聚糖為唯一碳源的分離培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)2～3 d，每個(gè)梯度重復(fù)3次。從中挑取生長(zhǎng)良好的菌落接種于斜面培養(yǎng)基保存。（4）菌種初篩：將分離出的菌種點(diǎn)接在初篩培養(yǎng)基平板上，置于30℃培養(yǎng)2～3 d，凡在菌落周圍能使剛果紅褪色形成透明圈的菌株，即為產(chǎn)酶菌株。將篩選出的菌株連續(xù)重復(fù)3次點(diǎn)接在初篩培養(yǎng)基上，挑選透明圈與菌落直徑之比大的菌株，接種斜面保存并編號(hào)。（5）菌種純化：將初篩出來(lái)的菌種點(diǎn)接在PDA培養(yǎng)上，連續(xù)培養(yǎng)5代，至每個(gè)菌種的每個(gè)菌株的菌落形態(tài)、顏色等相同，并在顯微鏡下觀察菌絲體、孢子的形態(tài)，直至純化為止。（6）菌種復(fù)篩：取斜面保藏的菌種，接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，接種到液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中（250 mL三角瓶，內(nèi)裝50 mL已滅菌的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基），于30℃，150 r/min搖床恒溫培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)過(guò)程結(jié)束后，取發(fā)酵液進(jìn)行β-葡聚糖酶活力的測(cè)定。（7）酶活力的測(cè)定：采用DNS比色法[4-5]。取4 mL搖瓶發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心10 min。取上清液用0.2 mol/L、pH值5.0的乙酸緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，取經(jīng)40℃預(yù)熱的此稀釋液1.0 mL，加入經(jīng)40℃預(yù)熱的1.0% β-葡聚糖溶液1.0 mL，混勻，加入蒸餾水混勻，40℃下恒溫反應(yīng)10 min，然后加入2.0 mL DNS停止反應(yīng)，搖勻，100℃水浴5 min，冷卻至室溫后用去離子水定容至5.0 mL，測(cè)定OD520值。取稀釋酶液1.0 mL，先加入2.0 mLDNS，再加入1.0%β-葡聚糖溶液1.0 mL為空白溶液。酶活定義：在本試驗(yàn)條件下，每分鐘分解β-葡聚糖產(chǎn)生相當(dāng)于l μmol葡萄糖所需的酶蛋白的量定義為一個(gè)酶活單位。

1.2.2 菌種初步鑒定[6-7]（1）菌落形態(tài)特征觀察：將保藏的菌種接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行菌種活化，活化后輕輕點(diǎn)接于PDA平板中央，30℃下恒溫培養(yǎng)2～3 d，3次重復(fù)，培養(yǎng)期間觀察菌落形態(tài)特征，并進(jìn)行記錄、拍照。（2）顯微鏡下觀察（插片法）：取融化并冷卻至大約50℃的PDA培養(yǎng)基約20 mL倒平板，待培養(yǎng)基凝固后，將菌種劃線在培養(yǎng)基上，以無(wú)菌操作用鑷子將無(wú)菌的蓋玻片以大約45°角插入培養(yǎng)基內(nèi)，其中蓋玻片與插入的面與劃的線平行，每個(gè)平板插3個(gè)，將平板倒置，30℃下恒溫培養(yǎng)，3次重復(fù)。待菌絲在蓋玻片上的長(zhǎng)度大約0.5 cm后，用鑷子小心拔出蓋玻片，擦去背面培養(yǎng)物，然后將有菌的一面朝上放在載玻片上，在顯微鏡下鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種初篩結(jié)果

將分離后的菌株接種于初篩培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫培養(yǎng)，能夠產(chǎn)生透明圈的菌株共有48株，如表1所示，透明圈直徑與菌落直徑之比>1.4的菌株有9株。

表1 平板初篩結(jié)果

2.2 菌種復(fù)篩結(jié)果

將初篩得到的9株菌株進(jìn)行純化，純化后的菌株接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，分析各菌株的產(chǎn)酶活力情況，結(jié)果如圖1所示，透明圈直徑與菌落直徑之比最大以及酶活最高的菌株為ZJ2132，因此，確定該菌株為后續(xù)研究的出發(fā)菌株。圖2為ZJ2132純化后30℃培養(yǎng)48 h后產(chǎn)生的形態(tài)。

圖1 初篩菌株產(chǎn)β-葡聚糖酶活力比較

圖2 ZJ2132在初篩培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

2.3 菌種鑒定

2.3.1 菌落形態(tài)特征 將活化后的ZJ2132菌種劃線接種于PDA培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)3 d后，菌落平板如圖3所示：培養(yǎng)1 d時(shí)，菌落呈圓形、白色、致密，菌落直徑1 cm，菌絲呈白色，纖細(xì)；培養(yǎng)2 d時(shí)，菌落棉絮狀，產(chǎn)孢從束區(qū)排列成同心圓輪紋，中央產(chǎn)生綠色孢子，中央變成綠色，大部分菌絲為基內(nèi)菌絲，匍匐生長(zhǎng)，氣生菌絲較少，四周新生的菌絲為白色，菌落直徑達(dá)3.0 cm，中央出現(xiàn)隆起；培養(yǎng)3 d時(shí)，菌落圓形、致密，呈同心圓環(huán)狀向四周拓展，直徑達(dá)5.5 cm，綠色孢子布滿菌落，呈藍(lán)綠色，白色菌絲被覆蓋，培養(yǎng)基顏色無(wú)明顯變化，沒(méi)有明顯的滲出物，無(wú)明顯氣味。

圖3 ZJ2132菌種劃線接種形態(tài)

2.3.2 顯微鏡下的觀察（插片法） 菌種采用插片法進(jìn)行制片，然后在顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖4所示：菌種ZJ2132的菌絲為樹枝狀，非輪枝狀，有隔；分生孢子梗光滑、較粗，淡褐色；頂囊呈球形，淡綠色；小梗雙層、無(wú)色，分生孢子呈卵圓形。

圖4 ZJ2132鏡檢圖（油鏡100倍）

根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)與常用真菌》中關(guān)于木霉屬的描述，實(shí)驗(yàn)中菌落、菌絲及孢子等表現(xiàn)出的形態(tài)特征，將ZJ 2132菌株初步鑒定為木霉屬中的Trichoderma sp.。

3 結(jié)論

從土壤中采用剛果紅葡聚糖培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)生菌進(jìn)行篩選，分離出9株透明圈直徑與菌落直徑之比>1.4的菌株；通過(guò)搖瓶復(fù)篩，確定了一株產(chǎn)β-葡聚糖酶酶活相對(duì)較高的菌株，命名為ZJ2132，其產(chǎn)酶活性為142.36 U/mL；通過(guò)對(duì)菌株ZJ2132的菌落和個(gè)體形態(tài)特征的觀察，初步確定該菌株ZJ2132為木霉屬中的Trichoderma sp.。該菌株酶活高于大多文獻(xiàn)報(bào)道的產(chǎn)β-葡聚糖酶酶活，因此極具應(yīng)用開(kāi)發(fā)價(jià)值。

[1]郭小權(quán)，胡國(guó)良，劉 妹.β-葡聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用及β-葡聚糖酶在飼料中的應(yīng)用[J].江西飼料，2001（2）：11-13.

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[7]中國(guó)科學(xué)院微生物研究所《常見(jiàn)與常用真菌》編寫組.常見(jiàn)與常用真菌[M].北京：科學(xué)出版社，1973.