解曉軍，高媛媛，戚 舒，周 強(qiáng)

(中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∥昆蟲學(xué)研究所，廣東 廣州 510275)

植食性昆蟲與寄主植物的接觸包括取食和產(chǎn)卵兩個(gè)方面。取食既對(duì)植物組織造成了物理損傷，也掠奪了寄主的營(yíng)養(yǎng)，因而是普遍關(guān)注的焦點(diǎn)。近10多年來，隨著植物對(duì)昆蟲取食反應(yīng)的分子機(jī)理方面研究的深入，植物誘導(dǎo)抗蟲性機(jī)理越來越清楚。植物在遭受植食性昆蟲取食為害后，通過以茉莉酸、水楊酸和乙烯為主的一系列信號(hào)途徑，啟動(dòng)植物的直接或者間接防御體系[1-5]。

植食性昆蟲無論是將卵產(chǎn)在植物表面還是組織內(nèi)，卵本身對(duì)寄主植物并沒有直接危害。但產(chǎn)卵過程導(dǎo)致的機(jī)械損傷或是卵殼表面攜帶的化學(xué)物質(zhì)會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生影響，尤其是將卵產(chǎn)在組織內(nèi)的昆蟲，不僅其產(chǎn)卵器會(huì)對(duì)寄主組織造成傷害，而且產(chǎn)卵液會(huì)進(jìn)入植物組織，植物也勢(shì)必對(duì)這些外來刺激產(chǎn)生反應(yīng)。從生態(tài)策略上來說，產(chǎn)卵刺激為寄主植物提供了進(jìn)攻者后代數(shù)量等方面的信息，因此，植物完全有可能對(duì)植食性昆蟲的產(chǎn)卵行為產(chǎn)生反應(yīng)。植物對(duì)昆蟲產(chǎn)卵誘導(dǎo)產(chǎn)生的防御反應(yīng)的最大收益在于通過減少卵的存活數(shù)，阻滯幼蟲或正在產(chǎn)卵的雌蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，從而避免將來更大規(guī)模的取食為害[6]。

對(duì)雙子葉模式植物擬南芥Arabidopsis的研究表明，植食性昆蟲的產(chǎn)卵與取食一樣也能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生各種防御反應(yīng)[7-9]，主要表現(xiàn)為通過產(chǎn)生揮發(fā)物吸引天敵，起到間接防御作用[10]。Dawn等通過基因芯片技術(shù)研究?jī)煞N菜粉蝶產(chǎn)卵對(duì)擬南芥的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)卵特異性誘導(dǎo)了擬南芥的全面防御反應(yīng)[11]。但目前尚無昆蟲產(chǎn)卵誘導(dǎo)單子葉模式植物水稻Oryzasativa產(chǎn)生防御反應(yīng)方面的研究報(bào)道，而從褐飛虱Nilaparvatalugens(St?l)產(chǎn)卵特點(diǎn)來看，其危害方式完全有可能誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生更強(qiáng)的防御反應(yīng)。褐飛虱的產(chǎn)卵方式與蝶類不同，蝶類將卵產(chǎn)在葉表面，不會(huì)直接對(duì)葉片產(chǎn)生機(jī)械損傷；而褐飛虱用產(chǎn)卵器刺破水稻植株表皮，將卵塊產(chǎn)在葉鞘組織內(nèi)，其危害部位和深度與其對(duì)水稻的取食過程有高度的相似性，有可能像水稻應(yīng)對(duì)褐飛虱取食一樣[12-14]，啟動(dòng)水稻的防御反應(yīng)。

胰蛋白酶抑制劑(Bowman Birk Proteinase Inhibitor,BBPI)是一種典型的植物防御相關(guān)蛋白，也是研究最為詳細(xì)的植物防御物質(zhì)，它通過影響昆蟲對(duì)食物的消化而達(dá)到防御目的[15]，并被認(rèn)為是一種有效的防御物質(zhì)而在轉(zhuǎn)基因抗蟲植物中得到了廣泛應(yīng)用[16-17]。此外，BBPI合成酶基因也是茉莉酸信號(hào)途徑的標(biāo)志基因[18-21]。本研究以單子葉模式植物水稻及其主要害蟲褐飛虱產(chǎn)卵為切入點(diǎn)，以典型的植物防御相關(guān)蛋白水稻BBPI為指標(biāo)，分析水稻對(duì)褐飛虱產(chǎn)卵刺激的響應(yīng)，以期為研究水稻應(yīng)對(duì)褐飛虱產(chǎn)卵的防御反應(yīng)提供證據(jù)，并為深入了解產(chǎn)卵誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)的分子機(jī)理提供信息。

1 材料與方法

1)水稻品種：選用標(biāo)準(zhǔn)感性品種TN1,種子于室內(nèi)催芽后，分期單株移至塑料杯內(nèi)(直徑5 cm×7 cm)，在人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度(27±1) ℃、相對(duì)濕度 80%、光照14 L∶10 D。秧齡20 d時(shí)供試。

2)蟲源：褐飛虱于采自廣東省華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)稻田，在室內(nèi)感性品種七袋占上飼養(yǎng)多代。溫度(27±1)℃、相對(duì)濕度80%、光照14 L∶10 D。

3)水稻處理：取盆栽水稻進(jìn)行如下處理，褐飛虱產(chǎn)卵處理：在每株水稻幼苗的葉鞘部位接3頭剪除口針的羽化后3天的褐飛虱懷卵雌蟲(處于產(chǎn)卵高峰期)，分別處理水稻0(對(duì)照)，6，12，24，36，48 h。 褐飛虱取食處理：在每株水稻幼苗的葉鞘部位接3頭3齡的褐飛虱若蟲，分別處理水稻0(對(duì)照)，6，12，24，36，48 h。機(jī)械損傷處理： 在每株水稻幼苗的葉鞘部位用已消毒的4號(hào)昆蟲針刺20下，分別處理水稻0(對(duì)照)，6，12，24，36，48 h。以上每個(gè)處理重復(fù)3次。

4)基因表達(dá)的測(cè)定: 用RT-PCR的方法測(cè)定不同處理對(duì)水稻防御相關(guān)基因表達(dá)的影響。取不同處理的水稻葉片100 mg，在液氮冷凍條件下碾成粉末，在液氮揮發(fā)完全前將其移入2 mL的離心管，Trizol試劑盒(GibcoBRL)提供的方法提取水稻總RNA。 取1 g不同處理的水稻葉片總RNA，Invitrogen 公司的SuperScript Ⅱ 逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒合成cDNA第一鏈。PCR擴(kuò)增用rTaq DNA 聚合酶(TaKaRa)，擴(kuò)增條件：94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)后于72 ℃延伸8 min。逆轉(zhuǎn)錄及PCR所用特異性引物見表1。取5 L PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖(w=1%)電泳。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。熒光定量PCR的方法測(cè)定不同處理對(duì)水稻蛋白酶抑制劑基因表達(dá)的影響。水稻RNA的提取方法同上，取1 g不同處理的水稻葉片總RNA，TaKaRa公司的PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒合成cDNA第一鏈。用于熒光定量PCR的BBPI的特異引物和內(nèi)參基因Actin引物分別設(shè)計(jì)為：QPI-F：5′-GCTCATCTGCGAGGACATCT-3′，QPI-R：5′-TTCCTCATGGTCCACACAAG-3′，QActin-F：5′-ACTGTCCCCATCTATGAAGGA-3′，QActin-R：5′-CTGCTGGAATGTGCTGAGAGA-3′。據(jù)SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) Kit提供的方法，用ABI Prism 7900HT進(jìn)行熒光定量PCR，運(yùn)行條件為：預(yù)變性：95 ℃，30 s，1個(gè)循環(huán)；PCR反應(yīng)：95 ℃，5 s；60 ℃，30～34 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理取3個(gè)樣品，每個(gè)樣品的RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA在每次熒光定量PCR時(shí)進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，重復(fù)運(yùn)行3次。蛋白酶抑制劑基因的相對(duì)拷貝數(shù)根據(jù)2-ΔΔCT 方法[22]進(jìn)行分析。

5)水稻蛋白酶抑制劑PI含量的測(cè)定: 酶液的提取: 參照Ward等[23]的方法。取處理后的水稻幼苗植株，稱量，按m∶v=1∶10的比例加入0.2 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 7.8)內(nèi)含w=0.1% Tween-20，冰浴勻漿，勻漿液在4 ℃，1 500 r/min離心15 min，上清液作為粗酶液。BBPI含量測(cè)定：取0.2 mL酶液和0.5 mL的0.1 μg/μL的胰蛋白酶溶液在室溫下振蕩混合10 min，加入100 μL的25 mg/mL偶氮酪蛋白，37 ℃培育30 min，再在12 000 r/min下離心10 min，取100 μL的上清液和100 μL的0.5 mol/L的NaOH，在DLAB全自動(dòng)酶標(biāo)儀上于450 nm下檢測(cè)吸光度值，以BBPI繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以μg/mg蛋白表示，總蛋白含量用Bradford方法測(cè)定[24]。

表1 PCR所用基因特異引物

2 結(jié) 果

2.1 褐飛虱產(chǎn)卵誘導(dǎo)水稻蛋白酶抑制劑合成酶基因(BBPI)的表達(dá)

BBPI通過影響昆蟲對(duì)植物進(jìn)行消化的蛋白酶的活性而在植物蟲害防御中去重要作用。褐飛虱產(chǎn)卵能誘導(dǎo)水稻BBPI的表達(dá)，機(jī)械損傷和褐飛虱取食也都能誘導(dǎo)蛋白酶抑制劑BBPI的表達(dá)，其中褐飛虱產(chǎn)卵和取食的誘導(dǎo)作用要強(qiáng)于機(jī)械損傷(圖1)。

圖1 防御物質(zhì)相關(guān)基因在褐飛虱產(chǎn)卵水稻中的表達(dá)

PR1，PR2，PR3均屬病原相關(guān)蛋白，在植物抗病蟲防御體系中起重要作用。褐飛虱產(chǎn)卵對(duì)病原相關(guān)基因PR1和PR3的表達(dá)都有誘導(dǎo)作用，但是對(duì)PR2的表達(dá)沒有誘導(dǎo)作用。褐飛虱取食也能誘導(dǎo)PR2和PR3的表達(dá)，而機(jī)械損傷對(duì)這三個(gè)基因的表達(dá)都沒有誘導(dǎo)作用(圖1)。

水稻植株BBPI的定量檢測(cè)表明：褐飛虱產(chǎn)卵能比較顯著的誘導(dǎo)PI基因的表達(dá)，并且基因的表達(dá)量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)。產(chǎn)卵刺激后12 h的PI基因的表達(dá)量最高，為對(duì)照的2.99倍，并且顯著高于6 h和24 h的表達(dá)量，但是6 h與24 h之間的表達(dá)量差異不顯著，而36 h和48 h時(shí)，BBPI的表達(dá)量基本上回復(fù)到了對(duì)照的水平(圖2)。

將褐飛虱產(chǎn)卵對(duì)BBPI的定量誘導(dǎo)表達(dá)作用與其它處理方式進(jìn)行對(duì)比，產(chǎn)卵刺激的前期(6 h和12 h)，葉片胰蛋白酶抑制劑基因的表達(dá)均顯著高于取食和機(jī)械損傷。處理后6 h，褐飛虱產(chǎn)卵與褐飛虱取食和機(jī)械損傷之間對(duì)基因的定量誘導(dǎo)表達(dá)作用差異顯著，褐飛虱產(chǎn)卵處理的誘導(dǎo)作用顯著強(qiáng)于取食處理；處理后12 h，褐飛虱產(chǎn)卵的誘導(dǎo)作用與其它兩種處理方式差異顯著。

圖2 定量PCR檢測(cè)不同處理方式對(duì)水稻BBPI的誘導(dǎo)表達(dá)

2.2 褐飛虱產(chǎn)卵對(duì)水稻蛋白酶抑制劑(BBPI)含量變化的影響

水稻植株BBPI含量檢測(cè)表明：與對(duì)照相比，褐飛虱產(chǎn)卵能比較顯著的誘導(dǎo)BBPI含量上升，對(duì)照植株與褐飛虱產(chǎn)卵處理后6，12，24，36，48 h水稻BBPI的含量分別為每g 蛋白10.77，11.13，13.05，12.47，10.92和10.97 mg。褐飛虱產(chǎn)卵誘導(dǎo)下BBPI的含量逐漸上升，12 h時(shí)達(dá)到最大值，含量上升狀態(tài)一直持續(xù)到處理后24 h，隨后開始下降，處理后36 h，BBPI的含量基本上回復(fù)到對(duì)照水平(圖3)。

圖3 不同處理方式對(duì)水稻BBPI含量變化的影響

將褐飛虱產(chǎn)卵對(duì)水稻BBPI含量的誘導(dǎo)作用與其它處理方式進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)：褐飛虱產(chǎn)卵，取食和機(jī)械損傷處理下BBPI的含量都是先上升后下降，產(chǎn)卵處理下的BBPI含量的最高值要低于褐飛虱取食處理下的最高值，并且達(dá)到最高值的時(shí)間(處理后12 h)晚于取食處理的6 h；褐飛虱產(chǎn)卵與機(jī)械損傷處理下BBPI的含量差異不顯著，但是褐飛虱取食處理下BBPI的含量為每g 蛋白13.68 mg,明顯高于前兩種處理(df=3,F=1 185,P=0.001)(圖3)。

3 討 論

昆蟲在和植物的長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過程中，發(fā)展了許多獨(dú)特的保護(hù)及適應(yīng)機(jī)制[25]。植食性昆蟲產(chǎn)卵行為有豐富的生態(tài)學(xué)功能，如雌性昆蟲的產(chǎn)卵液中含有雄性個(gè)體在交配過程中傳遞的附腺分泌物和雌性自身的分泌物，能同時(shí)表達(dá)雌雄個(gè)體的信息；通過在卵表面增加覆蓋物以防衛(wèi)來自捕食者、寄生者、病原微生物等自然天敵的攻擊和防止水分散失過多的作用[26]。最近的研究發(fā)現(xiàn)多種昆蟲卵內(nèi)含有與抗病蟲相關(guān)的信號(hào)物質(zhì)茉莉酸和水楊酸[27]，這表明產(chǎn)卵在植物與昆蟲相互關(guān)系中可能起著重要而又復(fù)雜的作用。

對(duì)水稻誘導(dǎo)抗蟲反應(yīng)的研究表明：褐飛虱取食和產(chǎn)卵刺激都能誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生BBPI，但是二者之間的誘導(dǎo)強(qiáng)度以及發(fā)揮誘導(dǎo)作用的時(shí)間存在著一定的差異，產(chǎn)卵處理下，BBPI量的變化呈先上升后下降的趨勢(shì)；而取食處理誘導(dǎo)的變化趨勢(shì)沒有這么明顯，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。褐飛虱產(chǎn)卵為害誘導(dǎo)BBPI的表達(dá)量達(dá)到最大值的時(shí)間基本上都晚于褐飛虱取食為害，并且產(chǎn)卵處理下防御基因表達(dá)量的最高值一般都低于取食處理。其原因可能是褐飛虱產(chǎn)卵處理的為害程度較小從而造成了誘導(dǎo)作用的延后發(fā)揮，或者是由于褐飛虱取食和產(chǎn)卵分別是通過不同的途徑來激活水稻的防御，從而導(dǎo)致基因表達(dá)量達(dá)最大值時(shí)誘導(dǎo)時(shí)間的差異，這需要進(jìn)一步的深入研究。

產(chǎn)卵誘導(dǎo)水稻BBPI的產(chǎn)生，并可能參與啟動(dòng)植物的超敏反應(yīng)。由于產(chǎn)卵誘導(dǎo)的BBPI在36 h后就下降到對(duì)照水平，而幼蟲可能需要9～10 d才能孵化[28]，因此，卵誘導(dǎo)產(chǎn)生的BBPI也就無法起到抑制幼蟲取食的作用。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：褐飛虱將卵產(chǎn)在水稻組織內(nèi)后形成產(chǎn)卵痕，產(chǎn)卵痕周圍的水稻組織會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞壞死的現(xiàn)象，從而形成明顯的產(chǎn)卵斑，這與在不相容的植物-病原物互作中寄主受病原物侵染的部位出現(xiàn)的壞死斑相似。由于BBPI不僅是植物抵抗昆蟲取食的一個(gè)重要因子，而且還能限制微生物對(duì)植物的入侵行為[29]。因此推測(cè)，褐飛虱產(chǎn)卵誘導(dǎo)的BBPI可能首先參與水稻產(chǎn)生超敏反應(yīng)，抵抗傷口感染微生物。褐飛虱將卵產(chǎn)在水稻的葉鞘組織內(nèi)的過程中，水稻受到雙重傷害，即褐飛虱的產(chǎn)卵器不僅傷害了水稻組織，而且將卵留在了水稻組織內(nèi)。產(chǎn)卵痕周圍組織的壞死可能有兩方面的原因，一是產(chǎn)卵器的直接傷害而導(dǎo)致組織細(xì)胞失水枯死；二是水稻對(duì)褐飛虱產(chǎn)卵或留在組織內(nèi)的卵產(chǎn)生超敏反應(yīng)，水稻組織出現(xiàn)程序性壞死。褐飛虱卵與水稻組織被隔離開來，胚胎發(fā)育因缺少水分供應(yīng)受到影響，最終對(duì)卵產(chǎn)生直接防御作用。

植物能夠及時(shí)的啟動(dòng)防御反體系應(yīng)對(duì)昆蟲產(chǎn)卵，從而有效的阻止孵化出的幼蟲對(duì)其造成的取食為害，這種早期預(yù)警行為消耗的時(shí)間和能量比較少，所以在一年生植物中比在多年生植物中常見，具體闡述一年生植物如何平衡這種“成本-收益”，可能需要更多的對(duì)發(fā)育和生殖參數(shù)方面的研究[30]。

產(chǎn)卵誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)的激發(fā)子特性現(xiàn)在仍然不知道，但是推測(cè)和包被在卵表面的輸卵管分泌物有關(guān)[31]。如果昆蟲卵只是與植物表面接觸并且產(chǎn)卵過程中沒有對(duì)植物造成傷害，則能誘導(dǎo)植物做出防御的與卵有關(guān)的誘導(dǎo)因子需要與植物的表皮細(xì)胞相接觸，然后誘導(dǎo)因子要么是高親脂性的以透過植物表面的蠟層，要么需要具有切開植物表皮的功能。一旦誘導(dǎo)因子到達(dá)表皮細(xì)胞后，它會(huì)通過受體或者形成通道的方式進(jìn)入細(xì)胞。如果昆蟲產(chǎn)卵時(shí)對(duì)植物造成了傷害，誘導(dǎo)因子就會(huì)通過被破壞的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。因此，深入對(duì)昆蟲產(chǎn)卵液中的信號(hào)刺激物的研究是解決植物-昆蟲產(chǎn)卵相互關(guān)系的突破口。

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