周 穩(wěn)，付 烈，王俊卿，熊 平，汪浩勇

(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430068)

燃料乙醇作為能源具有污染小、可再生等諸多優(yōu)點(diǎn)，各國(guó)均致力于提高燃料乙醇生產(chǎn)效率的研究[1]。釀酒酵母是目前發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的主要菌種，但其生長(zhǎng)慢、發(fā)酵周期長(zhǎng)、耐乙醇能力較差，難以用于高濃度乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)[2]。而運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌具有發(fā)酵周期短、糖類轉(zhuǎn)化率高、耐乙醇能力強(qiáng)以及遺傳改造簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，是良好的燃料乙醇生產(chǎn)菌種[3]。

大腸桿菌能利用戊糖和己糖，但缺乏相關(guān)高效率乙醇代謝酶，幾乎不產(chǎn)生乙醇[4]。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌只能利用葡萄糖、果糖以獨(dú)特的ED途徑生成乙醇[5]。自然界最豐富的是纖維素[6]，其水解液的主要成分為己糖(葡萄糖、半乳糖)以及大量的戊糖等，其中木糖是戊糖最主要的成分。如果運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能發(fā)酵纖維素水解液生產(chǎn)廉價(jià)的燃料乙醇，對(duì)解決未來能源短缺具有重大意義和潛在價(jià)值[7，8]。

作者通過基因工程手段用大腸桿菌的木糖代謝基因xylA、xylB、tktA、talB構(gòu)建木糖代謝和利用轉(zhuǎn)座載體pXT，轉(zhuǎn)座運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌而使其獲得發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的新代謝途徑，獲得了能同時(shí)利用葡萄糖和木糖高效生產(chǎn)乙醇的基因工程重組菌。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株、試劑和培養(yǎng)基

1.1.1 菌株(表1)

表1 4種實(shí)驗(yàn)菌株

ZM-CP4來自ZM ATCC31821；ZM-hym和大腸桿菌E.coliDH5α，由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏；運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌不能合成兩種氨基酸：賴氨酸和甲硫氨酸[9]。作者所在實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建了含有賴氨酸合成酶基因(YfdZ)、甲硫氨酸合成酶基因(MetB)和熱休克蛋白基因(Hsp)的轉(zhuǎn)座載體pHYM，通過轉(zhuǎn)座重組原始菌ZM-CP4得到了重組菌ZM-hym。

ZM-xt：用木糖代謝和利用轉(zhuǎn)座載體pXT轉(zhuǎn)座重組原始菌ZM-CP4，得到ZM-xt，作為對(duì)照菌；

ZM-mtc9xt：用木糖代謝和利用轉(zhuǎn)座載體pXT轉(zhuǎn)座重組菌ZM-hym，得到ZM-mtc9xt。

1.1.2 試劑

Pfu DNA聚合酶，NEB公司；T4DNA連接酶和各種限制性內(nèi)切酶，大連寶生物公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒和膠回收試劑盒，長(zhǎng)沙安比奧生物技術(shù)公司；酵母粉，Sigma公司；葡萄糖、木糖、氯化鎂以及各種抗生素等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基：1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1% NaCl，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂，121℃滅菌30 min。

ZM培養(yǎng)基：10%葡萄糖，0.1%尿素，1%酵母粉，0.1%磷酸二氫鉀，0.05%硫酸鎂，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂，pH值6.0，115℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：0.1%尿素，1%酵母粉，0.1%磷酸二氫鉀，0.05%硫酸鎂，隨發(fā)酵條件添加不同濃度糖溶液，pH值6.0，115℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 DNA操作方法

細(xì)菌基因組DNA的提取、PCR產(chǎn)物及DNA片段的純化，質(zhì)粒DNA提取、酶切、連接、轉(zhuǎn)化以及各種感受態(tài)細(xì)胞的制備等參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。質(zhì)粒DNA的小量提取和純化參照試劑盒操作說明。

1.2.2 轉(zhuǎn)座載體pXT的構(gòu)建

以大腸桿菌E.coliK12基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得大腸桿菌木糖代謝相關(guān)基因xylA、xylB、tktA和talB，其大小分別為1.4 kb、1.5 kb、1.4 kb和2.0 kb。以野生型運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌基因組DNA為模板，PCR 擴(kuò)增獲得gap和eno基因啟動(dòng)子序列片段，其大小分別為0.25 kb和0.2 kb。利用PCR重疊技術(shù)，將gap基因啟動(dòng)子序列和xylA/xylB基因序列融合，片段大小為3.2 kb。將eno啟動(dòng)子序列和talB/tktA基因序列融合，片段大小為3.6 kb。將克隆的融合片段連接到運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌轉(zhuǎn)座載體上構(gòu)建木糖代謝和利用轉(zhuǎn)座載體pXT。

1.2.3 轉(zhuǎn)座

在大腸桿菌中構(gòu)建好轉(zhuǎn)座載體pXT后，取10 μL轉(zhuǎn)座載體與5 μL轉(zhuǎn)座酶混合，37℃水浴2 h，取3 μL與ZM-CP4或ZM-hym混合，電擊后于ZM培養(yǎng)基中32℃培養(yǎng)4 h后涂板。轉(zhuǎn)座載體pXT分別轉(zhuǎn)入ZM-hym和原始菌ZM-CP4獲得基因工程菌ZM-mtc9xt及ZM-xt。

1.2.4 重組菌株篩選

1.2.4.1 木糖平板篩選

將電擊轉(zhuǎn)座后的細(xì)菌加入1 mL ZM培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后，離心去上清，用無菌生理鹽水稀釋，涂布以3%木糖為唯一碳源并含有1‰四環(huán)素的固體培養(yǎng)基上，32℃厭氧罐中培養(yǎng)3 d以上。同等條件下以未轉(zhuǎn)化的原始菌ZM-CP4及ZM-hym作為對(duì)照。

挑取木糖板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)座子接種于50 mL ZM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，抽取基因組DNA，設(shè)計(jì)4對(duì)檢驗(yàn)引物，分別對(duì)木糖代謝基因xylA、xylB、tktA、talB進(jìn)行PCR鑒定，大小應(yīng)為0.48 kb、0.73 kb、0.55 kb、0.81 kb。同樣條件下以ZM-CP4及ZM-hym的基因組DNA作為對(duì)照。PCR鑒定正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)座子加入等體積的40%滅菌甘油，于-80°C冰箱中低溫保存。

1.2.5 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

(1)單糖發(fā)酵：取PCR鑒定正確的細(xì)菌各1 mL接種于9 mL ZM培養(yǎng)基中，24 h后按10%的接種量分別接入含23%葡萄糖或含6%木糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，密封，32℃、60 r·min-1振蕩培養(yǎng)60 h，測(cè)乙醇產(chǎn)量。

(2)混合糖發(fā)酵：取各保藏實(shí)驗(yàn)菌株1 mL接種于9 mL ZM培養(yǎng)基中，24 h后按10%的接種量接入含17%葡萄糖+6%木糖的混合糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，密封，32℃、60 r·min-1振蕩培養(yǎng)60 h，測(cè)乙醇產(chǎn)量。

考察了溫度(32℃、40℃)、培養(yǎng)基中酵母粉濃度(質(zhì)量體積比，分別為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)對(duì)混合糖發(fā)酵的影響。

1.2.6 乙醇產(chǎn)量測(cè)定

對(duì)照組尿潴留發(fā)生率為27.59%,相比于研究組的6.89%高出許多,統(tǒng)計(jì)學(xué)存在差異(P<0.05),結(jié)果如下表1:

乙醇產(chǎn)量采用GC7890F型氣相色譜儀(上海天美有限公司)測(cè)定，以異丁醇作為內(nèi)標(biāo)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌種的初篩與PCR鑒定

重組菌在以3%木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況見圖1。

圖1 重組菌在以3%木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

由圖1可知，轉(zhuǎn)座后的細(xì)菌涂布木糖板72 h后，板上長(zhǎng)出少量白色菌落，而未轉(zhuǎn)座的原始菌ZM-CP4及ZM-hym木糖板上未見白色菌落生長(zhǎng)。

重組菌基因組DNA的PCR鑒定結(jié)果見圖2。

圖2 重組菌基因組PCR鑒定(左：ZM-mtc9xt；右：ZM-xt)

由圖2可知，1%的瓊脂糖凝膠電泳顯示，4對(duì)檢驗(yàn)引物擴(kuò)增的PCR片段大小分別約為0.5 kb、0.8 kb、0.6 kb、0.8 kb，與設(shè)計(jì)相符。而原始菌ZM-CP4及ZM-hym基因組DNA的PCR鑒定結(jié)果均為陰性，表明兩種重組菌中確實(shí)包含木糖代謝基因xylA、xylB、tktA和talB。共獲得76個(gè)轉(zhuǎn)座陽(yáng)性細(xì)菌。

2.2 23%葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)和6%木糖單糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

所獲得的76個(gè)轉(zhuǎn)座陽(yáng)性細(xì)菌中，有些不能利用葡萄糖，有些利用葡萄糖發(fā)酵乙醇能力大幅度下降。實(shí)驗(yàn)只保留能高效生成乙醇的轉(zhuǎn)座陽(yáng)性菌株。經(jīng)過4輪篩選，共獲得8個(gè)能高效利用葡萄糖發(fā)酵生成乙醇的轉(zhuǎn)座陽(yáng)性菌株，其在23%葡萄糖、6%木糖發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)乙醇的情況見圖3、圖4。

圖3 各菌株23%葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

圖4 各菌株6%木糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

由圖3可知，在含23%葡萄糖的發(fā)酵條件下，重組菌ZM-xt2和ZM-mtc9xt1最高乙醇產(chǎn)量分別為102.7 g·L-1和98.3 g·L-1，而原始菌ZM-CP4和ZM-hym的乙醇平均產(chǎn)量分別為97.2 g·L-1和106.4 g·L-1。雖然重組菌的乙醇產(chǎn)量略低于ZM-hym，但卻高于原始菌ZM-CP4，這可能是由于轉(zhuǎn)入了新的基因使得細(xì)菌的能量代謝負(fù)擔(dān)加重，乙醇產(chǎn)量有少許下降。但對(duì)重組菌高效發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乙醇的能力沒有影響。

原始菌ZM-CP4和ZM-hym在木糖發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)不能生長(zhǎng)，而重組菌ZM-xt(1～4)和ZM-mtc9xt(1～4)均能在木糖發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)正常生長(zhǎng)。由圖4可知，在6%木糖發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵60 h后，ZM-xt(1～4)和ZM-mtc9xt(1～4)均能發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇，但各菌株發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的能力各不相同，其中ZM-xt1和ZM-mtc9xt3發(fā)酵能力最強(qiáng)，乙醇產(chǎn)量分別為24.9 g·L-1和24.1 g·L-1。

綜上可知，ZM-xt1和ZM-mtc9xt3在6%木糖發(fā)酵培養(yǎng)基中乙醇產(chǎn)量最高且能高效發(fā)酵23%葡萄糖，因此用ZM-xt1和ZM-mtc9xt3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 17%葡萄糖+6%木糖混合糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5)

圖5 各菌株17%葡萄糖+6%木糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

由圖5可知，在混合糖發(fā)酵條件下，原始菌ZM-CP4和ZM-hym的平均乙醇產(chǎn)量分別為72.7 g·L-1和75.3 g·L-1。ZM-xt1的平均乙醇產(chǎn)量為83.8 g·L-1，與ZM-CP4和ZM-hym相比，分別提高了15%和12%。ZM-mtc9xt3的平均乙醇產(chǎn)量為88.9 g·L-1，與ZM-CP4和ZM-hym相比，分別提高了22%和18%。該結(jié)果表明，大腸桿菌的木糖代謝和利用基因，能在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中與運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的ED途徑相偶聯(lián)，利用木糖產(chǎn)乙醇，提高了混合糖發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量。

2.4 溫度對(duì)混合糖發(fā)酵的影響(圖6)

圖6 溫度對(duì)混合糖發(fā)酵的影響

由圖6可知，在17%葡萄糖+6%木糖混合糖發(fā)酵時(shí)，與32℃發(fā)酵相比，40℃時(shí)各菌株的乙醇產(chǎn)量均有所下降。原始菌ZM-CP4與ZM-xt1的平均乙醇產(chǎn)量分別降低了47%和48%，而含有Hsp基因的ZM-hym和ZM-mtc9xt3平均乙醇產(chǎn)量?jī)H分別降低6%和9%。由此可知，含有Hsp基因的重組菌ZM-mtc9xt3對(duì)溫度的耐受性顯著提高。

2.5 酵母粉濃度對(duì)混合糖的影響(圖7)

圖7 酵母粉濃度對(duì)混合糖發(fā)酵的影響

由圖7可知，在酵母粉濃度為0～0.4%時(shí)，各菌株的乙醇產(chǎn)量差別不明顯。在酵母粉濃度為0.4%～0.8%時(shí)，ZM-mtc9xt3乙醇產(chǎn)量增加了60.4 g·L-1，ZM-hym乙醇產(chǎn)量增加了55.4 g·L-1，ZM-xt1乙醇產(chǎn)量增加了45.6 g·L-1，而原始菌乙醇產(chǎn)量?jī)H增加39.6 g·L-1。含有hym基因的ZM-mtc9xt3乙醇產(chǎn)量分別比ZM-xt1和原始菌ZM-CP4提高了32%和53%。說明在hym基因的作用下，ZM-mtc9xt3比ZM-xt1和原始菌ZM-CP4更能適應(yīng)在低酵母粉濃度的混合糖發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。在酵母粉濃度為0.8%～1.0%時(shí)，菌株ZM-xt1和原始菌ZM-CP4乙醇產(chǎn)量才開始迅速增加，而ZM-mtc9xt3和ZM-hym的乙醇產(chǎn)量則增加平緩。但由于混合糖培養(yǎng)基中還含有6%木糖，整合了木糖代謝和利用基因的ZM-mtc9xt3最終乙醇產(chǎn)量比ZM-hym提高了9%。說明在低營(yíng)養(yǎng)物酵母粉濃度的葡萄糖和木糖混合糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，ZM-mtc9xt3更能有效地利用各種糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇。

3 結(jié)論

近年來，在關(guān)于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的相關(guān)報(bào)道中，研究人員多采用穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌[11]，但其發(fā)酵性能不穩(wěn)定，且需加入各種抗生素維持[12，13]。本實(shí)驗(yàn)首次將外源基因xylA、xylB、tktA和talB通過轉(zhuǎn)座方式整合到運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的基因組DNA上，通過篩選得到能發(fā)酵木糖高效產(chǎn)乙醇的重組菌ZM-mtc9xt3，在17%葡萄糖+6%木糖混合糖發(fā)酵中乙醇產(chǎn)量為88.9 g·L-1，比原始菌ZM-CP4提高了22%。且所構(gòu)建的重組菌ZM-mtc9xt3能在較低營(yíng)養(yǎng)條件和較高溫度下高效發(fā)酵產(chǎn)乙醇，更適于工業(yè)化應(yīng)用，有望生產(chǎn)低成本廉價(jià)乙醇。

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