湯楚華，施生根，牛忠英，黨 平，李 丹

(解放軍306醫(yī)院全軍口腔疾病診治中心，北京 100101)

細(xì)胞應(yīng)力實(shí)驗(yàn)研究是組織工程和細(xì)胞工程的基礎(chǔ)之一，近年來的研究表明，從器官、組織到細(xì)胞、亞細(xì)胞等各個(gè)層次上的生命運(yùn)動(dòng)都是在一定力學(xué)環(huán)境中進(jìn)行的，機(jī)械力深刻影響著細(xì)胞和組織的生長(zhǎng)、維持和重建［1］。牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligament fibroblasts，HPLF)作為牙周膜的主體細(xì)胞在咀嚼、咬合等狀態(tài)下，必然要承受各種機(jī)械力的刺激，近年研究發(fā)現(xiàn)牙周膜成纖維細(xì)胞對(duì)不同形式、大小、頻率和時(shí)間的應(yīng)力所產(chǎn)生的反應(yīng)是復(fù)雜的［2］。HPLF的增殖活力直接反映了牙周組織生長(zhǎng)改建的狀態(tài)，但是壓力對(duì)HPLF增殖活力的影響及其在不同時(shí)段是如何變化的，目前尚不清楚。本研究通過四唑鹽(MTT)比色試驗(yàn)，探討HPLF增殖活力與壓力值、壓力作用時(shí)間的關(guān)系，以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)壓力對(duì)HPLF功能的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

低糖DMEM和胰蛋白酶(Gibco，美國(guó));胎牛血清(華美生物工程公司);噻唑藍(lán)(MTT Sigma，美國(guó));二甲基亞砜(DMSO，Sigma，美國(guó));96孔培養(yǎng)板(Costar，美國(guó));醫(yī)用凈化工作臺(tái)(北京半導(dǎo)管儀器廠);倒置相差顯微鏡(Olympus，日本);自動(dòng)CO2培養(yǎng)箱(HERAcell，德國(guó));Model 550酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BIO－RAD，美國(guó))。

1.2 人牙周膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

經(jīng)病人或(和)其家長(zhǎng)同意，取12～16歲因正畸減數(shù)拔除的無齲、無牙周病的第一前磨牙，無菌條件下刮取根中1/3的牙周膜，采用酶消化－組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)［3］，成功傳代后，選用第6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞加載裝置和方法

本研究所用的細(xì)胞加載裝置是由北京航空航天醫(yī)學(xué)研究所研制的液壓細(xì)胞加載裝置，主要由高壓儲(chǔ)氣室、氣流量調(diào)控器、細(xì)胞加載室、壓力檢測(cè)器組成，高壓儲(chǔ)氣室儲(chǔ)備950 mL/L空氣和50 mL/L CO2。該裝置具有精密的自動(dòng)控制系統(tǒng)，可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生精確可調(diào)的恒定液壓。實(shí)驗(yàn)時(shí)，按設(shè)計(jì)方案，將細(xì)胞培養(yǎng)板放入加載室內(nèi)，通過高壓儲(chǔ)氣室和氣流量調(diào)控器將氣體輸入細(xì)胞加載室內(nèi)，作用于細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生液壓。

1.4 方法

1.4.1 不同力值壓力對(duì)HPLF增殖活力的影響

取生長(zhǎng)良好的第6代HPLF，2.5 g/L胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)后，以1×104/孔接種于4塊96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL。將培養(yǎng)板移入 CO2孵箱中，在37℃、50 mL/L CO2、飽和濕度條件下，培養(yǎng)24 h后，將 4 塊培養(yǎng)板隨機(jī)分為對(duì)照組、0.25、0.5、1.0 MPa壓力組，每塊板為一大組，對(duì)照組不予加壓，其他3組細(xì)胞分別接受相應(yīng)的壓力刺激30 min。然后再將各組細(xì)胞置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，在加力后 6、12、18、24、30、36 h 檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活力，每小組測(cè)5孔。

1.4.2 同一壓力作用不同時(shí)間對(duì)HPLF增殖活力的影響

取生長(zhǎng)良好的第6代HPLF以1×104/孔接種于4塊96孔板，按上述條件培養(yǎng)24 h后，將4塊培養(yǎng)板隨機(jī)分為對(duì)照組、加載10 min組、30 min組、50 min組，對(duì)照組不予加壓，其他3組細(xì)胞分別接受1.0 MPa壓力刺激相應(yīng)的時(shí)間。然后，再將各組細(xì)胞置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，在加力后6、12、18、24、30、36 h檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，每小組測(cè)5孔。

1.5 四唑鹽(MTT)比色試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

在上述各實(shí)驗(yàn)規(guī)定的觀察時(shí)間，分別取各小組細(xì)胞，加入噻唑藍(lán)(MTT，5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)孵育4 h，每孔加入二甲基亞砜終止反應(yīng)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較用SNK法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同力值壓力對(duì)HPLF增殖活力的影響

經(jīng)方差分析，F(xiàn)=9.73，P ＜0.05，各組之間存在差異(表1)。

表1 不同壓力對(duì)HPLF增殖活力的影響(OD值，)

表1 不同壓力對(duì)HPLF增殖活力的影響(OD值，)

*與對(duì)照組相比P＜0.05

時(shí)間(h) 對(duì)照組 壓力值(MPa)0.25 0.5 1.06 0.286 ±0.028 0.290 ±0.034 0.281 ±0.0410.226 ±0.036*12 0.291 ±0.029 0.292 ±0.029 0.291 ±0.0300.168 ±0.023*18 0.294 ±0.021 0.302 ±0.024 0.297 ±0.0260.210 ±0.047*24 0.310 ±0.027 0.322 ±0.049 0.301 ±0.0240.297 ±0.03230 0.328 ±0.045 0.328 ±0.044 0.331 ±0.0440.328 ±0.03836 0.348 ±0.032 0.352 ±0.034 0.346 ±0.0330.335 ±0.046

2.1.1 各實(shí)驗(yàn)組HPLF的OD值變化趨勢(shì)

對(duì)照組、0.25 MPa組、0.5 MPa組 HPLF 的 OD值隨著觀測(cè)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，1.0 MPa組在受力后的12 h內(nèi)OD值呈下降趨勢(shì)，12 h后隨著觀測(cè)時(shí)間的延長(zhǎng)OD值逐漸升高。

2.1.2 壓力對(duì)HPLF的OD值的影響

0.25 、0.5 MPa組在各個(gè)時(shí)點(diǎn)與對(duì)照組相比無顯著性差異(P＞0.05);1.0 MPa組與對(duì)照組相比有顯著性差異，表現(xiàn)為細(xì)胞在受力后6 h時(shí)OD值顯著降低(P＜0.05)，12 h時(shí) OD值進(jìn)一步降低(P＜0.05);18 h時(shí)OD值雖有所回升但差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);24 h以后各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比均無顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 相同壓力作用不同時(shí)間對(duì)HPLF增殖活力的影響

經(jīng)方差分析，F(xiàn)=9.10，P ＜0.05，各組之間存在差異，SNK法多組均數(shù)間兩兩比較結(jié)果(表2)。

表2 壓力作用不同時(shí)間對(duì)HPLF增殖活力的影響(OD值，)

表2 壓力作用不同時(shí)間對(duì)HPLF增殖活力的影響(OD值，)

*與對(duì)照組相比P＜0.05

時(shí)間(h) 對(duì)照組 加載時(shí)間(min)10 30 506 0.286 ± 0.028 0.291 ± 0.033 0.226 ±0.033* 0.217 ± 0.063*8 ±0.05312 0.291 ± 0.029 0.294 ± 0.037 0.168 ±0.023* 0.155 ± 0.025*18 0.294 ± 0.021 0.301 ± 0.032 0.210 ±0.047* 0.207 ± 0.042*24 0.310 ± 0.027 0.324 ± 0.046 0.297 ±0.032 0.292 ±0.03930 0.328 ± 0.045 0.332 ± 0.049 0.328 ±0.038 0.326 ±0.04236 0.348 ± 0.032 0.345 ± 0.042 0.335 ±0.046 0.32

2.2.1 各實(shí)驗(yàn)組HPLF的OD值變化總趨勢(shì)

對(duì)照組、加載10 min組HPLF的OD值隨著觀測(cè)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高;加載30 min組與加載50 min組在受力后的12 h內(nèi)OD值呈下降趨勢(shì)，12 h后OD值隨著觀測(cè)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高。

2.2.2 相同壓力作用不同時(shí)間對(duì)HPLF的OD值的影響

加載10 min組在各個(gè)時(shí)點(diǎn)與對(duì)照組相比均無顯著性差異(P＞0.05);加載30 min組和加載50 min組與對(duì)照組相比，在細(xì)胞受力后6 h時(shí)OD值即有明顯降低(P＜0.05)，12 h時(shí)OD值進(jìn)一步降低(P＜0.05)，18 h時(shí)OD值雖有所回升，但差異仍有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，24 h以后各時(shí)間點(diǎn)OD值與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。加載50 min組與加載30 min組之間相比無顯著性差異(P＞0.05)。

3 討論

HPLF是形成新的牙周組織的細(xì)胞基礎(chǔ)，牙周組織再生修復(fù)首先要有一定數(shù)量的、健康的牙周膜細(xì)胞。因此了解應(yīng)力對(duì)HPLF生物學(xué)行為的影響，首先就要了解細(xì)胞的增殖活力情況。由于牙周膜位于牙槽骨與牙骨質(zhì)兩種硬組織之間，體內(nèi)研究其受力情況存在諸多困難，因此，只能通過三維有限元、體外細(xì)胞模擬加載等方面來了解。而且還受壓力裝置的條件限制，以前實(shí)驗(yàn)所提供的最大壓力值僅約200 kPa，不能反映口腔的實(shí)際情況。鑒于牙周膜所受壓強(qiáng)的個(gè)體差異較大，本研究以下頜第一磨牙平均咬合力除以平均牙周膜面積來粗略估計(jì)牙周膜所受壓強(qiáng)的數(shù)量級(jí)。根據(jù)北京醫(yī)科大學(xué)對(duì)462例青壯年男女檢測(cè)所得下頜第一磨牙咬合力均數(shù)40～50 kg，魏治統(tǒng)等測(cè)量下頜第一磨牙牙周膜面積為346 mm2，則粗略估計(jì)牙周組織所受壓強(qiáng)(N/m2)為 1 ～ 1.5 MPa［4－5］。同時(shí)考慮到牙周韌帶的緩沖作用會(huì)減小咬合壓力引起的組織液液壓改變及傳遞至HPLF的壓力，HPLF的實(shí)際受力相對(duì)估計(jì)值可能稍小，故本研究選用壓強(qiáng)分別為0.25、0.5、1.0 MPa。

對(duì)于機(jī)械應(yīng)力對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞增殖活力的影響，以前報(bào)道的結(jié)果并不一致，原因在于力的性質(zhì)、力值大小、作用時(shí)間、作用方式有所不同。Matsuda等報(bào)道HPLF經(jīng)受為期4 d 9%或18%的間歇性張力刺激后，其增殖活力受到輕度地抑制;Kletsas等給予HPLF牽張力作用1～6 h后，發(fā)現(xiàn)牽張力可以促進(jìn)細(xì)胞DNA合成從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖加快;而Yamaguchi則報(bào)道HPLF經(jīng)為期5 d的循環(huán)拉伸后，實(shí)驗(yàn)組HPLF增殖與對(duì)照組并無明顯差異［6－8］。張曉東等給予HPLF牽張力刺激后，發(fā)現(xiàn)頻率為0.1 Hz時(shí)，12%的牽張應(yīng)力對(duì)牙周膜細(xì)胞促增殖作用強(qiáng)，18%的牽張應(yīng)力對(duì)HPDLF的增殖有抑制作用;持續(xù)性牽張應(yīng)力促增殖作用最?。?］。

Yousefian等發(fā)現(xiàn)在壓力持續(xù)作用24、48 h后，較小負(fù)壓對(duì)HPLF增殖有顯著促進(jìn)作用，較小正壓對(duì)HPLF增殖有顯著抑制作用［10］。本課題組張惠采用細(xì)胞加載裝置對(duì)細(xì)胞施以30、60、90 kPa壓力，每日3次，每次15 min，發(fā)現(xiàn)在這種反復(fù)多次壓力刺激下，細(xì)胞增殖受到抑制，該抑制作用隨壓力值增大而增強(qiáng)［11］。Yamamoto等在不含氣體的容器中，對(duì)人牙周膜細(xì)胞施加流體靜壓1 MPa，分別持續(xù)10、60 min;6 MPa持續(xù)60 min，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞沒有發(fā)生形態(tài)學(xué)上的改變，細(xì)胞的活力也沒有受到影響［12］。

本研究結(jié)果表明:0.25、0.5 MPa組 OD值在各個(gè)時(shí)點(diǎn)與對(duì)照組相比無顯著性差異，1.0 MPa組與對(duì)照組相比有顯著性差異，表現(xiàn)為受力后6 h時(shí)OD值與對(duì)照組相比即有顯著降低，12 h時(shí)OD值進(jìn)一步降低，18 h有所回升，24 h以后與對(duì)照組無差異。提示力值的大小與細(xì)胞增殖活力之間存在一定的關(guān)系，細(xì)胞的活力在此加載范圍內(nèi)隨著壓力的增大而有所降低。Pavlidis等對(duì)大鼠右側(cè)上頜第一磨牙施加0.25和0.5 N的持續(xù)力4 h，采用免疫組化方法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)在牙周膜細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)張力側(cè)和壓力側(cè)的細(xì)胞陽性染色率均較對(duì)照組低，說明細(xì)胞增殖活力受到抑制［13］。這與本研究壓力作用下HPLF增殖活力降低這一結(jié)果相一致。

1.0 MPa的壓力作用10 min對(duì)細(xì)胞OD值沒有顯著影響，1.0 MPa的壓力作用30、50 min后，OD值在受力后6 h即明顯下降，12 h時(shí)降低最為明顯，18 h有所回升，24 h以后與對(duì)照組無差異。加載50 min組較加載30 min組OD值略低，但是兩者沒有明顯差異。這可能因?yàn)榧?xì)胞具有蠕變和應(yīng)力松弛的特征，在靜壓力的作用下，細(xì)胞逐漸發(fā)生形變，在短時(shí)間內(nèi)會(huì)對(duì)細(xì)胞的增殖和代謝產(chǎn)生影響，但是這種形變發(fā)生在一段時(shí)間后會(huì)趨向穩(wěn)定，細(xì)胞會(huì)因?yàn)榧虞d時(shí)間的延長(zhǎng)失去對(duì)應(yīng)力的敏感性。本研究還觀察到加力后24 h后各項(xiàng)指標(biāo)均恢復(fù)至對(duì)照組水平，提示在此加載時(shí)間內(nèi)，壓力對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的影響是可逆的。

［1］白靈，樊瑜波，張明.離體培養(yǎng)細(xì)胞的力學(xué)實(shí)驗(yàn)方法［J］.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2002，19(2):324－328.

［2］Krishnan V，Davidovitch Z.Cellular，molecular，and tissuelevel reactions to orthodontic force［J］.Am J Orthod Dentofacial Orthop，2006，129(4):469.e1 －32.

［3］湯楚華，施生根，牛忠英，等.酶消化組織塊法原代培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞的初步研究［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2004，84(8):656－658.

［4］皮昕.口腔解剖生理學(xué)［M］.4版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:208－209.

［5］馬軒祥.口腔修復(fù)學(xué)［M］.5版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2004:147－148.

［6］Matsuda N，Yokoyama K，Takeshita S，et al.Role of epidermal growth factor and its receptor in mechanical stress－induced differentiation of human periodontal ligament cells in vitro［J］.Arch Oral Biol，1998，43(12):987 －997.

［7］Kletsas D，Basdra EK，Papavassiliou AG.Mechanical stress induces DNA synthesis in PDL fibroblasts by a mechanism unrelated to autocrine growth factor action［J］.FEBS Lett，1998，430(3):358－362.

［8］Yamaguchi M，Shimizu N，Shibata Y，et al.Effects of different magnitudes of tension－force on alkaline phosphatase activity in periodontal ligament cells［J］.J Dent Res，1996，75(3):889－894.

［9］張曉東，李永明，宋九余，等.加載牽張應(yīng)力對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響［J］.臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，26(8):464－467.

［10］Yousefian J，F(xiàn)irouzian F，Shanfeld J.A new experimental model for studying the response of periodontal ligament cells to hydrostatic pressure ［J］.Am J Orthod Dentofacial Orthop，1995，108(4):402－409.

［11］張惠，施生根，宋應(yīng)亮.人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖與壓力關(guān)系的初步觀察［J］.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2001，17(2):130－133.

［12］Yamamoto T，Kita M，Kimura I，et al.Mechanical stress induces expression of cytokines in human periodontal ligament cells［J］.Oral Dis，2006，12(2):171 －175.

［13］Pavlidis D，Bourauel C，Rahimi A，et al.Proliferation and differentiation of periodontal ligament cells following short－term tooth movement in the rat using different regimens of loading.Eur J Orthod，2009，31(6):565－571.