姜月艷 方劍利 毛 強 童培建

股骨頭壞死是激素在臨床廣泛應用后被公認的主要并發(fā)癥之一，目前激素性股骨頭壞死的發(fā)病率已經(jīng)超過了外傷所致的股骨頭壞死［1，2］。激素性股骨頭壞死的發(fā)病機制尚未被完全闡明，目前主要存在的學說有骨質疏松學說、脂肪栓塞學說、血管病變學說、骨內(nèi)高壓學說等［3～5］。但尚無一能明確闡釋其確切病機病程［6］。所以臨床對SINFH也缺乏相應特異有效的藥物［7］。

隨著基因技術的發(fā)展，對SINFH的病機研究逐漸深入到細胞分子機制和基因層面［8，9］?，F(xiàn)在越來越多的研究顯示，氧化應激在SINFH的發(fā)生發(fā)展過程中起作用，而與氧化應激相關的基因在SINFH的發(fā)生發(fā)展過程中亦有不同程度的表達［10，11］。那么是否可以通過抑制氧化應激而達到防治SINFH的目的呢?于是就這一設想我們進行了本項實驗研究，希望可以借此為中藥防治SINFH提供一點思路。

材料與方法

1.材料:(1)實驗動物:成年健康Wistar大鼠20只，雌雄各半，體重200±10g;喂食大鼠普通飼料。于清潔級環(huán)境中飼養(yǎng)，正壓屏障系統(tǒng)，空氣經(jīng)過3級過濾，空氣潔凈度達萬級;24h循環(huán)光照，自由攝食飲水，每個標準籠飼養(yǎng)5只。以上實驗動物、飼料及設施均由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。(2)實驗試劑和儀器:大腸桿菌內(nèi)毒素 L2880(美國Sigma公司);甲潑尼龍(美國Pfizer公司);多聚甲醛(天津市化學試劑研究所);中性甲醛緩沖溶液(衢州巨化有限公司);Prime-ScriptTM RT reagent試劑盒(日本 TaKaRa公司);BioEasy SYBR GreenⅠReal Time PCR試劑盒(中國Bioer Technology公司)、Leica RM2016切片機(德國Leica公司);櫻花全封閉組織脫水機(日本SAKURA公司);Microm EC350模塊化組織包埋機(德國Thermo公司)。(3)右歸飲制備:稱取30倍量處方，加1L水浸泡1h后，加10倍水于密閉式高壓自動煎藥鍋內(nèi)煎煮，提取1.5小時/次，提取2次;所得提取液趁熱過四層紗布后合并，放冰箱內(nèi)冷藏12h后，以4000r/min，3℃下離心15min，共2次。合并上清液，加熱至沸騰，趁熱放置冰箱內(nèi)冷藏12h后，再以4000r/min，3℃下離心15min，共2次，合并上清液，濃縮到密度為1.35g/ml，于60℃減壓干燥。干燥物碾細，過120目篩子后得到右歸飲細粉。

2.方法:(1)實驗動物分組及模型制備:20只 Wistar大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，精確稱重，采用隨機數(shù)字表法分為模型對照組和右歸飲治療組，每組10只。兩組大鼠均按2μg/100g劑量經(jīng)腹腔注射大腸桿菌內(nèi)毒素2次，每次間隔24h。最后1次注射大腸桿菌內(nèi)毒素24h后，再按4mg/100g劑量經(jīng)左側臀肌注射甲潑尼龍，連續(xù)注射3次，每次間隔24h。最后一次注射甲潑尼龍24h后，模型對照組予以蒸餾水1ml/100g灌胃，每天1次，共6周。右歸飲治療組:按1ml/100g劑量右歸飲灌胃，每天1次，共6周。(2)標本制備:于第6周末采集左側股骨頭標本。大鼠稱重后，按4ml/kg劑量腹腔注射水合氯醛，麻醉成功后，依次固定，備皮，消毒。嚴格無菌手術下迅速取出連同大小轉子在內(nèi)的左側股骨頭，盡量除去周圍軟組織后，肉眼觀察股骨頭形態(tài)、關節(jié)軟骨色澤及外形(由專人記錄)，再從冠狀面切開，其中一半經(jīng)焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)水漂洗后立即投入液氮中保存，用于基因芯片檢測、實時熒光定量PCR檢測和免疫組化檢測;另一半投入100g/L多聚甲醛溶液中保存，用于組織病理學觀察。(3)組織病理學觀察:本研究主要通過HE染色對所取標本進行組織病理學觀察。具體方法如下:將所取標本置于體積分數(shù)為10%的中性甲醛溶液(0.1mol/L，pH7.4)中固定3天，然后置于100g/L EDTA－Tris緩沖液中脫鈣，每周更換脫鈣液1次，以大頭針能無阻力刺進骨密質為完全脫鈣標準。脫鈣完全后，再逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，沿冠狀位切片，切片厚度為4μm，切片后行常規(guī) HE染色，光鏡下觀察。(4)基因芯片檢測:此項實驗操作委托上海晶泰生物技術有限公司操作完成?；蛐酒瑱z測數(shù)據(jù)見表1。(5)基因芯片數(shù)據(jù)驗證:主要運用實時熒光定量PCR技術。具體方法如下:實時熒光定量PCR檢測方法:選定基因芯片發(fā)現(xiàn)的下調表達基因Gclc、SOD3和COX6A2，用同一RNA樣品，通過實時熒光定量PCR檢測，對基因芯片數(shù)據(jù)進行驗證。采用兩步法完成實時熒光定量PCR整個檢測過程。先將提取出的總RNA(0.5μg)應用 PrimeScriptTMRT reagent試劑盒，通過 Thermo-ScriptTMreverse transcriptase(RT)－PCR System合成 cDNA。合成的cDNA(2μl)采用BioEasy SYBR GreenⅠReal Time PCR試劑盒通過real－time PCR(ABIPRISM 7000)進行擴增。設立看家基因β－actin作為內(nèi)參，與目的基因在同一條件下進行擴增反應。結果通過序列檢測軟件(ABIPRISM 7000)獲得。特定基因引物根據(jù)GenBank公布的序列，應用Primer Express(Applied Biosystems CA，USA)軟件進行設計。并由上海生工生物技術有限服務公司合成引物，各引物具體序列見表2?；虮磉_水平以β－actin表達水平進行校正。在相對定量分析中，實時熒光定量PCR的結果以Ct值顯示，Ct值為每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，Ct值越大，表達量越低。平均△Ct值為樣本目的基因的平均Ct值減去β－actin的平均Ct值。用模型對照組的平均△Ct值為標準計算出右歸飲治療組的2－△△Ct，以2－△△CT代表目的基因的相對表達水平［6］。

3.統(tǒng)計學方法:所得數(shù)據(jù)應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，采用兩組獨立樣本t檢驗進行兩組樣本均數(shù)比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。本研究中，表達倍數(shù)變化2倍以上的基因數(shù)據(jù)經(jīng)We1ch T－test分析(P＜0.01)即確定為顯著差異表達基因。

表1 模型對照組及右歸飲治療組基因芯片數(shù)據(jù)差異譜

結 果

1.組織病理學觀察結果:(1)標本肉眼大體觀察:1)模型對照組:軟骨表面不光滑、色晦暗，部分皺縮，軟骨厚度明顯變薄，有部分軟骨表面剝脫、成臺階樣改變、軟骨下骨裸露和軟骨脫落后的部分肉芽變。2)右歸飲治療組:軟骨表面尚光滑、有光澤，部分皺縮，軟骨厚度變薄，未見軟骨表面剝脫。(2)組織病理學觀察:1)模型對照組:股骨頭結構完整，軟骨細胞排列紊亂，軟骨基質不均勻，在軟骨表面有纖維結締組織的增生，出現(xiàn)片狀軟骨鈣化，潮線斷續(xù)或消失，鈣化帶與軟骨下骨小梁斷裂或不連續(xù)。骨壞死區(qū)骨髓的病變特征為大片灶性或彌漫性骨髓壞死、溶解、滲出，髓內(nèi)小血管變性、壞死，非壞死區(qū)骨髓基本為脂肪細胞所取代，骨髓內(nèi)造血組織數(shù)目減少或接近消失，髓腔內(nèi)脂肪細胞增大，有的融合呈泡狀;骨細胞腫大，細胞核受壓變形、邊聚，有的胞核固縮、溶解、碎裂，空虛骨陷窩增多。骨壞死區(qū)主要集中在軟骨下區(qū)，可見壞死骨小梁間隙纖維組織增生，包繞骨小梁，內(nèi)有大量充血擴張的血管或靜脈竇，多核破骨細胞出現(xiàn)，未見新生骨沉積，軟骨下小血管明顯減少(圖1)。2)右歸飲治療組:股骨頭結構完整，軟骨基底層灶性變性，軟骨細胞排列不規(guī)則，軟骨基質不均勻，可見片狀軟骨鈣化，潮線部分斷續(xù)，鈣化帶與軟骨下骨小梁斷裂或不連續(xù)。骨小梁板層樣結構稀疏但較為整齊，骨小梁邊緣成骨細胞多見，軟骨下血管豐富。部分骨小梁內(nèi)骨細胞數(shù)減少，散在細胞核固縮，核深染，出現(xiàn)少量骨陷窩空虛。骨細胞核大居中，有空虛骨陷窩，但較模型組少，髓腔內(nèi)造血細胞較豐富，散在的骨髓細胞結構模糊或細胞結構消失，呈淡染的粉紅色區(qū)域，局部紅骨髓壞死(圖2)。

2.基因芯片檢測結果:基因芯片檢測結果顯示模型對照組與右歸飲治療組相比氧化應激相關基因中有32條基因的表達存在差異，其中18條表達上調，14條表達下調。經(jīng)分析，這些差異表達基因中有3條基因的表達存在顯著差異，且都成下調表達，見表2。這3條基因的功能分別涉及抑制ROS的生成、增加ROS的清除以及保護細胞免受氧化損傷等方面。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

3.實時熒光定量PCR檢測結果:選取基因芯片篩選出的3條明顯差異基因(Gclc、SOD3和COX6A2)進行實時熒光定量PCR驗證，結果見表3。

表3 實時熒光定量PCR結果比較(△CT值，)

表3 實時熒光定量PCR結果比較(△CT值，)

與模型對照組相比右歸飲治療組的Gclc、SOD3、COX6A2基因mRNA的表達下調，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)?？梢娀蛐酒瑱z測結果與RT－PCR檢測結果相符。

討 論

生物體內(nèi)的自由基主要為氧自由基(oxygen derived freeradicals，OFR)。這些氧自由基以及由它們衍生的單線態(tài)氧(O2)、過氧化氫(H2O2)和脂質過氧化物(RO－、OO－與ROOH)等，統(tǒng)稱為活性氧(reactive oxygen species，ROS)［12，13］。細胞內(nèi)的 ROS有多種來源，許多細胞內(nèi)的酶促化學反應途徑均生成ROS。除線粒體呼吸鏈外，內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶(eNOS)、還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶、細胞色素P450氧化酶、黃嘌呤氧化酶、環(huán)氧化酶和脂氧合酶催化的反應均伴有活性氧的產(chǎn)生［14］。

新近研究表明氧化應激幾乎參與了生物體所有疾病的發(fā)病過程，其參與機制主要包括引起血管損傷和細胞凋亡［15～18］。亦有研究表明血管損傷參與了SINFH的發(fā)病過程，而細胞凋亡也被認為是SINFH的發(fā)病機制之一［15～23］。因此，可推測氧化應激參與了SINFH的發(fā)生發(fā)展過程。另一方面，臨床上在治療SINFH時運用的一些抗氧化應激藥物(如他汀類藥物 statins，ACEI類，TZDs，CCB 等)也都取得了一定療效，這也反證了氧化應激在SINFH的發(fā)病過程中起作用［24，25］。目前關于中醫(yī)藥防治SINFH的研究也越來越多，右歸飲作為中醫(yī)補腎的經(jīng)典名方，將其運用于SINFH大鼠模型后，其對SINFH大鼠股骨頭組織結構產(chǎn)生了一定影響(表現(xiàn)為股骨頭結構較模型對照組完整，骨小梁板層樣結構也較模型對照致密整齊，空骨陷窩率遠低于模型對照)。研究的主要思路是嘗試從分子生物學角度闡明右歸飲抗氧化應激進而防治SINFH的分子機制。本研究運用基因芯片技術，發(fā)現(xiàn)了3個右歸飲抗氧化應激相關顯著差異基因(Gclc、SOD3和COX6A2)，提示此3個基因可能是SINFH發(fā)病的關鍵基因［26～28］。本研究為研究SINFH的發(fā)病機制及其防治提供了一個新的角度，在此基礎上，可進一步運用其他基因技術(如基因敲除、基因導入等)來探討SINFH的發(fā)病機制及行之有效的防治方法，并最終戰(zhàn)勝SINFH。

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