方穎，段雪云，2，王宏飛，范恒，劉焱文

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)湖北省中藥資源與中藥復(fù)方省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430065;2.湖北省中醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430065;3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430022)

纈草(Valeriana officinalis L.)為敗醬科纈草屬植物，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為纈草有安心神、祛風(fēng)濕、行氣血、鎮(zhèn)痛的功效;現(xiàn)代藥理研究表明，纈草提取物對(duì)由烏頭堿、哇巴因、腎上腺素等誘發(fā)的心律失常動(dòng)物模型均有良好的對(duì)抗作用，延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程和有效不應(yīng)期，抑制心肌自律性［1］;能明顯對(duì)抗乙酰膽堿一氯化鈣誘發(fā)的小鼠心房顫動(dòng)(房顫)和三氯甲烷誘發(fā)的小鼠心室顫動(dòng)(室顫)，也能明顯對(duì)抗大鼠由結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支誘發(fā)的早期缺血性心律失常［2］。

為了闡釋纈草的抗心律失常物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)室采用超臨界二氧化碳(CO2)萃取法和系統(tǒng)溶劑法，將纈草分為不同提取部位，然后以烏頭堿、三氯甲烷兩種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)心律失常的模型進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)，確定纈草抗心律失常的主要活性部位［3-4］。在活性部位篩選的基礎(chǔ)上，采用色譜法，對(duì)主要活性部位的化學(xué)成分進(jìn)行了初步分離，得到8-羥基松脂醇苷等十幾個(gè)單體化合物，以轉(zhuǎn)基因Kv1.5HEK293細(xì)胞為受試對(duì)象，采用膜片鉗全細(xì)胞記錄電流的方法對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行抗心律失常的作用篩選研究，旨在從細(xì)胞通道水平闡明其抗心律失常的作用機(jī)制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 倒置顯微鏡 OLYMPUS IX71(日本Olympus公司)，膜片鉗放大器(HEKAEPC-9 Germen)，PULSE 軟件(HEKA lambrecht Germen)，玻璃電極(南京六合泉水教學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器廠)，微電極拉制儀(P-97 Sutter Instrumentco，Norato，CA)，恒流泵 HL-2B(上海滬西分析儀器廠)。

1.2 試藥 纈草中分離的單體成分8-羥基松脂醇苷，其他試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞株 轉(zhuǎn)基因Kv1.5HEK293細(xì)胞由香港大學(xué)惠贈(zèng)。

2 材料與方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 將細(xì)胞約3×105個(gè)置培養(yǎng)瓶中(25 cm)，加含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)達(dá)爾伯克改良必需基本培養(yǎng)基(Dulbecco＇s modified minimal essential medium，DMEM)5mL，置37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)80% ～90%融合時(shí)，即可進(jìn)行傳代。將磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)、培養(yǎng)基、胰酶等液體在37℃水浴預(yù)熱。先棄去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，再用PBS沖洗，后加入胰酶消化液約2.5mL，并輕柔搖動(dòng)，使消化酶流遍所有細(xì)胞表面，在顯微鏡下觀察到貼壁生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因Kv1.5細(xì)胞回縮，胞體趨于變圓，細(xì)胞間縫隙變大時(shí)，立即終止消化，加入含血清的培養(yǎng)基約2.5mL，并用吸管反復(fù)吹打，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來成單個(gè)懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇 細(xì)胞凍存時(shí)采用逐步降溫，依次在4℃冰箱放置0.5 h，－20℃冰箱放置0.5 h，然后放入－80℃冰箱24 h，即可轉(zhuǎn)移到液氮罐(－170℃)中長(zhǎng)期保存;首先按細(xì)胞傳代方法將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞消化下來，轉(zhuǎn)移到離心管中，低速離心留取細(xì)胞沉淀。然后用預(yù)先配制的細(xì)胞凍存液重新懸起細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，分裝入凍存管中，注明細(xì)胞名稱和凍存日期。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，從液氮罐中取出凍存管，迅速放入37℃水浴中，不停地輕輕搖動(dòng)凍存管，使細(xì)胞可以盡快解凍。復(fù)蘇后24 h更換新鮮培養(yǎng)基。

2.3 溶液的配制 蒂羅德(Tyrode’s)液:氯化鈉137mmol·L-1、氯 化 鉀 5.4mmol·L-1、氯 化 鎂1.0mmol·L-1、氯化鈣 1.8mmol·L-1、磷酸二氫鈉0.33mmol·L-1、4-羥乙基呱嗪乙磺酸 10mmol·L-1、葡萄糖10mmol·L-1，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.4;電極內(nèi)液:天門冬氨酸鉀 120mmol·L-1，氯化鉀20mmol·L-1，4-羥乙基哌嗪乙磺酸5mmol·L-1，氯化鎂 21mmol·L-1，ATP敏感性鉀(ATP-sensitive potassium，K-ATP)4mmol·L-1，乙二醇-雙-(2-氨基乙酸)四乙酸10mmol·L-1，磷酸肌酸二鈉 2mmol·L-1，用氫氧化鉀調(diào) pH到7.3;所有電極內(nèi)液均用孔徑0.22 μm微孔濾膜過濾。供試品溶液:取適量從纈草中分離單體成分8-羥基松脂醇苷，臨用前溶于100%二甲亞砜中，配成相應(yīng)的濃度，備用。

2.4 全細(xì)胞膜片鉗記錄方法 采用全細(xì)胞膜片鉗記錄方法，在電壓鉗制模式下記錄通道電流［5］。膜片鉗放大器通過A/D和D/A數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換器同計(jì)算機(jī)相連接，刺激信號(hào)及電壓、電流輸入信號(hào)的采集均由軟件PULSE控制。

實(shí)驗(yàn)在室溫(22～24℃)下進(jìn)行，吸取少許細(xì)胞懸液于0.5mL的灌流槽中，靜置5～10 min，待細(xì)胞貼壁后，用100% 氧氣飽和的細(xì)胞外液進(jìn)行表面灌流5～10 min，流速2mL·min-1。在倒置顯微鏡下選擇邊緣清晰，表面光滑，立體感強(qiáng)，無收縮的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了排除灌流對(duì)細(xì)胞電流的影響，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中采用細(xì)胞外液進(jìn)行表面持續(xù)灌流，流速2mL·min-1。玻璃電極充灌電極內(nèi)液后入水電阻為1～2 ΜΩ。由于轉(zhuǎn)基因Kv1.5細(xì)胞體積較小，記錄通道電流時(shí)所用電極尖端開口較小，電極入液電阻2～3 ΜΩ。調(diào)節(jié)三維操縱器使電極尖端移向細(xì)胞表面，形成高阻封接，封接電阻＞1 GΩ。補(bǔ)償快電容并吸破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞記錄模式。調(diào)節(jié)慢電容補(bǔ)償和串聯(lián)電阻補(bǔ)償70%～80%以減少瞬時(shí)充放電電流和鉗位誤差，然后在電壓鉗模式下記錄電流，保持電壓固定于－80 mV，階躍電壓10 mV，指令電位的步階范圍由－50 mV至60 mV，持續(xù)時(shí)間 300 ms，然后電壓保持在－50 mV，150 ms，分別記錄給予維拉帕米20 μmol·L-1前和5 min后穩(wěn)定的電流，該電流的后部分被抑制達(dá)70%以上，該電流激活較快，基本不失活，呈電壓依賴性，可被維拉帕米所阻斷，與人心房肌細(xì)胞IKur類似［6］，證實(shí)該電流系人Kv1.5通道的電流。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 電生理資料由 Patch、Clampfit、Sigmaplot軟件處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，通過SPSS 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用藥前后比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 8-羥基松脂醇苷對(duì)轉(zhuǎn)基因Kv1.5細(xì)胞電流時(shí)間依賴曲線的影響 采用上述實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)條件，分別用含 8-羥基松脂醇苷 0，10，30 μmol·L-1的電極外液灌流5 min，觀察電流變化，在不同濃度下電流減小，記錄不同濃度灌流前后，以及洗脫后的電流圖，見圖1。結(jié)果隨著給藥時(shí)間的推移，電流逐漸減小并漸趨穩(wěn)定，洗脫后緩慢恢復(fù)，并逐漸穩(wěn)定到最大值。見圖2。

3.2 8-羥基松脂醇苷對(duì)轉(zhuǎn)基因Kv1.5細(xì)胞電流單刺激曲線的作用 保持電壓固定于－50 mV，然后電壓保持在50 mV，持續(xù)300 ms的單刺激條件下所記錄的電流圖，與將分別用含8-羥基松脂醇苷0 μmol·L-1(對(duì)照組)，10 μmol·L-1，30 μmol·L-1的電極外液灌流5 min后，所記錄的電流進(jìn)行曲線擬合，得出圖3。給藥10 μmol·L-1后的電流，較對(duì)照組明顯有所減小;給藥30 μmol·L-1后的電流，較對(duì)照組明顯減小，且對(duì)整個(gè)電流的抑制作用較10 μmol·L-1增強(qiáng)。抑制率分別為27.3% 和 35.6%(n=8，P＜0.05)。與串刺激下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)所得結(jié)論一致。

圖1 不同濃度的8-羥基松脂醇苷對(duì)轉(zhuǎn)基因Kv1.5細(xì)胞的電流影響A 用藥前;B.10 μmol·L-1;C.30 μmol·L-1;D 洗脫后Fig.1 The effects of different concentrations of 8-hydroxy resin glycosides on the currents of the Kv1.5 HEK293 cellsA.before the treatment of 8-hydroxy resin glycosides;B.10 μmol·L-1;C.30 μmol·L-1;D.after the elution

圖2 8-羥基松脂醇苷對(duì)轉(zhuǎn)基因Kv1.5電流時(shí)間依賴曲線的影響A.用藥前;B.用藥后;C.洗脫后Fig.2 The effects of 8-hydroxy resin glycosides on the time dependency curve of the Kv1.5 HEK293 cellsA.before the treatment;B.after the treatment;C.after the elution

圖3 8-羥基松脂醇苷對(duì)轉(zhuǎn)基因Kv1.5電流單刺激曲線的作用Fig.3 The effects of 8-hydroxy resin glycosides on the stimulus curve of the Kv1.5 HEK293 cells

3.3 8-羥基松脂醇苷對(duì)轉(zhuǎn)基因Kv1.5細(xì)胞電流密度曲線的影響 保持電壓固定于－80 mV，階躍電壓10 mV，指令電位的步階范圍由－50 mV至60 mV，持續(xù)時(shí)間300 ms，然后電壓保持在－50 mV，持續(xù)150 ms，測(cè)定到Kv1.5通道電流，在指令電壓+60 mV時(shí)，用含8-羥基松脂醇苷10，30 μmol·L-1的電極外液灌流5 min后，使 Kv1.5 通道電流值從(148.3±13.0)PA/PF 分別降至(109.4±4.0)PA/PF 和(78.6±11.3)PA/PF，與對(duì)照組比較抑制率分別為28.5% 和37.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，n=6)。見圖4。

4 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，8-羥基松脂醇苷對(duì)轉(zhuǎn)基因Kv1.5細(xì)胞電流有抑制作用，洗脫后電流基本恢復(fù)正常(略較用藥前偏低);不同濃度對(duì)轉(zhuǎn)基因Kv1.5細(xì)胞電流影響不同，濃度越高抑制越明顯。推測(cè)電流與濃度可能也呈現(xiàn)一定的依賴性，可能在一定范圍內(nèi)，藥物濃度越高，細(xì)胞電流抑制作用越強(qiáng);并且沒有改變離子通道激活的特性。

基因Kv1.5細(xì)胞主要是電壓門控鉀通道(Kv1.5鉀通道)，其培養(yǎng)的細(xì)胞均為單鉀通道，阻止該通道會(huì)影響鉀電流，從而與心律失常密切相關(guān)。Kv1.5鉀通道電流是引起心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極的主要電流及Ⅲ類抗心律失常藥的主要靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)選取轉(zhuǎn)基因Kv1.5 HEK293細(xì)胞進(jìn)行觀察研究，HEK293細(xì)胞來源于人胚胎腎上皮細(xì)胞，也是常用的人心肌細(xì)胞離子通道基因體外表達(dá)系統(tǒng)。研究表明，HEK293細(xì)胞無內(nèi)源性 Kv1.5通道 mRNA的轉(zhuǎn)錄，其細(xì)胞膜上無 Kv1.5 通道表達(dá)［7-8］，作為Kv1.5 鉀通道體外細(xì)胞模型，可以排除內(nèi)源性 Kv1.5電流對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，超快速延遲整流鉀電流(ultrarapid delayed rectifier current，IKur)離子通道的分子基礎(chǔ)是Kv1.5鉀通道［9］，并且IKur是僅在心房肌發(fā)現(xiàn)的鉀通道電流，房顫時(shí)Ikur的變化非常重要，是潛在的心房選擇性抗房顫藥物的高敏靶點(diǎn)。由于HEK293是源于人的細(xì)胞系，以其為模型取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與人心肌細(xì)胞差異會(huì)更小。因此，藥物對(duì)轉(zhuǎn)基因Kv1.5鉀通道HEK293的電流有抑制作用，那么它可能有抗房顫作用。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，8-羥基松脂醇苷對(duì)轉(zhuǎn)基因Kv1.5鉀通道電流有抑制作用，說明其可能通過抑制IKur，延長(zhǎng)有效不應(yīng)期，而達(dá)到抗房顫的作用，不致室性心律失常，有一定研究前景。當(dāng)然人的心肌細(xì)胞主要有鈉、鉀、鈣3種離子通道，不同于本實(shí)驗(yàn)只選用轉(zhuǎn)基因Kv1.5細(xì)胞單個(gè)鉀通道作研究，該藥對(duì)人體心肌細(xì)胞多個(gè)通道作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步進(jìn)行。

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