孫黔云，葉巧玲，閆銀萍

(貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550002)

補(bǔ)體是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在機(jī)體防御、免疫調(diào)控中發(fā)揮著重要作用［1－3］。但補(bǔ)體在一定病理生理?xiàng)l件下的過度激活會(huì)引發(fā)炎癥和病理損傷［4－6］，尤其是補(bǔ)體的替代途徑在多種疾病和病理損傷中扮演了重要角色［7－8］。在這類補(bǔ)體相關(guān)疾病和病理損傷研究中，多采用小鼠構(gòu)建動(dòng)物模型進(jìn)行研究。但由于小鼠血清補(bǔ)體的特殊性，采用標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)體溶血活性測定方法無法測出其經(jīng)典途徑的溶血活性，而替代途徑的溶血活性即使能測出，也比較低［9－10］，且所需要的血清量對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)來說無法承受。因此，構(gòu)建可用于小鼠血清補(bǔ)體活性測定的新方法具有現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)室因開展補(bǔ)體抑制劑篩選評(píng)價(jià)工作需要，以3個(gè)常用品系小鼠的血清補(bǔ)體作為測定材料，采用眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)構(gòu)建了一種靈敏度高的小鼠血清補(bǔ)體替代途徑溶血活性測定的新方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料 眼鏡蛇毒采集于湖南省武陵山區(qū);蛋白分離凝膠和預(yù)裝純化柱購自瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司;兔抗綿羊紅細(xì)胞抗體(溶血素)、乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸(ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N，N，N'，N'-tetraacetic acid，EGTA)、明膠購自美國 Sigma 公司;其它試劑均為符合實(shí)驗(yàn)要求的國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。綿羊紅細(xì)胞、兔紅細(xì)胞和豚鼠紅細(xì)胞均采自貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采集的無菌血液經(jīng)玻珠脫纖維處理后保存于無菌阿氏液中，存放于4～8℃?zhèn)溆谩?6孔板為德國Greiner公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)KM小鼠、BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(渝)2007-0003。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物福利符合相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理?xiàng)l例。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔、恒溫、恒濕的環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)前均自由進(jìn)食和進(jìn)水。

1.3 儀器 AKTA prime蛋白純化儀、GeneQuant紫外分光光度計(jì)(瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司);Bio-Rad 550酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司);5810R冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司);Revco超低溫冰箱(美國Thermo公司)。Milli Q超純水系統(tǒng)和Elix純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.4 方法

1.4.1 血清制備 分別取KM、BALB/c和C57BL/6品系♀、♂小鼠各20只，制備每一品系小鼠單一性別的混合血清。采用戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠，打開腹腔，經(jīng)腹主靜脈取血，抽取的血液置于試管中，室溫放置1 h，然后置于4℃放置3 h，在4 ℃條件下，2 000 r· min－1離心10 min，吸取血清，混勻，分裝，凍存?zhèn)溆?。正常人血清是由本?shí)驗(yàn)室健康志愿者獻(xiàn)血制備的混合血清。制備的血清均保存于－80℃。每管凍存的血清只在臨用前取出化凍1次，化凍后未用完血清不再使用。

1.4.2 兩種抗補(bǔ)體蛋白的制備 CVF的分離純化和激活補(bǔ)體替代途徑的活力單位測定分別參照文獻(xiàn)［11－12］進(jìn)行。新型補(bǔ)體抑制蛋白Atrase B的制備和補(bǔ)體抑制活性的檢測參照文獻(xiàn)［13］進(jìn)行。制備的CVF和Atrase B凍存于－80℃，備用。

1.4.3 小鼠血清補(bǔ)體經(jīng)典途徑溶血活性測定 參照文獻(xiàn)方法［14］，有改動(dòng)。取適量凍存血清，室溫水浴快速化凍，用葡萄糖明膠巴比妥緩沖液(GGVB)分別稀釋成1∶2、1∶5、1∶10、1 ∶20 的稀釋液，取 100 μl稀釋血清與 100 μl致敏綿羊紅細(xì)胞懸液(5×1011cells·L－1，用 GGVB 配制)混勻，37℃水浴30 min，期間不時(shí)輕輕振搖，孵育完畢，加入1 ml冷生理鹽水終止反應(yīng)，2 000 r·min－1離心 10 min。取 200 μl上清液加入96孔板，于酶標(biāo)儀405 nm處測定吸光度。以正常人血清為實(shí)驗(yàn)體系質(zhì)控血清。

1.4.4 小鼠血清補(bǔ)體替代途徑溶血活性測定 參照文獻(xiàn)方法［13］，有改動(dòng)。分別取 20、40、60、80、100 μl化凍血清(不足100 μl者，以明膠巴比妥緩沖液(GVB)補(bǔ)足)，與 100 μl Mg-EGTA 2 × 緩沖液(含 4 mmol·L－1Mg2+和 16 mmol·L－1EGTA的GVB)混合，再與100 μl兔紅細(xì)胞懸液(1.5×1011cells·L－1，以含 2 mmol·L－1Mg2+和8 mmol·L－1EGTA 的GVB配制，以下均同)混勻，37℃水浴30 min后，加入0.5 ml冷生理鹽水終止反應(yīng)，離心，取300 μl上清液加入96孔板，于405 nm測定吸光度。以正常人血清為實(shí)驗(yàn)體系質(zhì)控血清。

1.4.5 CVF激發(fā)的小鼠血清替代途徑溶血 取不同量化凍血清(不超過 50 μl，以 GVB 補(bǔ)足至 90 μl)，與 100 μl Mg-EGTA 2×緩沖液、100 μl兔紅細(xì)胞懸液混合，再加入 10 μl不同濃度的CVF，混勻，37℃水浴30 min后，加入0.5 ml冷生理鹽水終止反應(yīng)，離心后按上述方法測定吸光度。

1.4.6 兩種抗補(bǔ)體蛋白對(duì)小鼠體內(nèi)血清補(bǔ)體活性影響的測定 通過尾靜脈注射，分別將CVF以0.02 U·g－1的劑量、Atrase B 以 20 μg·g－1和 40 μg·g－1的劑量給予對(duì)應(yīng)組別的BALB/c♂小鼠。通過眼眶采血，分別制備給藥前和給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的血清，采用本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的測定方法測定不同時(shí)間點(diǎn)血清補(bǔ)體的替代途徑溶血活性的變化。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清補(bǔ)體經(jīng)典途徑溶血活性 KM、BALB/c和C57BL/6品系小鼠的血清在1∶20、1∶10、1∶5甚至1∶2的稀釋度下均未發(fā)生經(jīng)典途徑的溶血(數(shù)據(jù)未列出)。

2.2 小鼠血清補(bǔ)體替代途徑溶血活性 KM、BALB/c和C57BL/6品系小鼠的血清均能產(chǎn)生一定程度的替代途徑溶血，但要達(dá)到合適的溶血度，單次測定則普遍需要約100 μl以上的血清量(Fig 1)。

2.3 CVF激發(fā)的小鼠血清補(bǔ)體替代途徑溶血 采用CVF激活小鼠血清補(bǔ)體替代途徑，可以明顯提高其替代途徑的溶血度(Tab 1)。

2.4 抗補(bǔ)體蛋白體內(nèi)活性測定 采用構(gòu)建的新方法，成功

測定了給藥后小鼠體內(nèi)血清補(bǔ)體活性的變化(Fig 2)。

3 討論

補(bǔ)體是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其功能由補(bǔ)體成分組成的不同活性反應(yīng)鏈來實(shí)現(xiàn)。因此，測定相關(guān)補(bǔ)體活性對(duì)于評(píng)價(jià)補(bǔ)體功能狀態(tài)和反映補(bǔ)體在一系列相關(guān)疾病和病理損傷中的作用和變化具有重要的意義和價(jià)值。而采用抗原抗體識(shí)別原理的免疫化學(xué)或酶聯(lián)免疫吸附測定方法往往無法分辨和識(shí)別正常補(bǔ)體蛋白與失活的補(bǔ)體蛋白、補(bǔ)體活化產(chǎn)物與完整蛋白的區(qū)別，其測定結(jié)果無法取代補(bǔ)體功能測定實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)3個(gè)常用品系小鼠KM、BALB/c、C57BL/6的血清補(bǔ)體活性進(jìn)行測定，結(jié)果表明，采用標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)體溶血活性實(shí)驗(yàn)無法檢測出小鼠血清補(bǔ)體的經(jīng)典途徑溶血活性，而小鼠血清補(bǔ)體的替代途徑溶血活性，即使能測出，也需要較多的血清，從而無法開展小鼠血清補(bǔ)體活性的測定。

Tab 1 Hemolytic activity of mouse serum complement challenged by CVF(%，n=6)

CVF是存在于眼鏡蛇毒中的一種高度特異的補(bǔ)體激活蛋白。在血清中，CVF與補(bǔ)體B因子特異結(jié)合，形成CVFB復(fù)合物，經(jīng)D因子的識(shí)別和酶切作用，轉(zhuǎn)化成補(bǔ)體替代途徑C3/C5轉(zhuǎn)化酶CVFBb，CVFBb不受內(nèi)源性補(bǔ)體調(diào)控蛋白的影響，可持續(xù)激活補(bǔ)體替代途徑，從而造成替代途徑成分的消耗。采用CVF激活補(bǔ)體，可有效提高補(bǔ)體激活效率，使補(bǔ)體活化反應(yīng)充分，從而可最大限度地提高補(bǔ)體活性變化的檢出靈敏度。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過篩選，確定加入的CVF合適劑量為1 U。對(duì)于♂C57BL/6和♂BALB/c小鼠而言，采用本方法只需要5～10 μl血清即可以獲得理想的溶血度;而對(duì)于KM小鼠，使用10～20 μl血清也可以獲得理想的溶血度，大大降低了血清使用量。只需較少的血清就可完成單次或多次重復(fù)測定，也使得測定小鼠血清補(bǔ)體的替代途徑溶血活力單位(APH50)具有了可行性。通過優(yōu)化該方法的測定條件，還可進(jìn)一步減少血清用量。另外，從新方法的測定結(jié)果中可以看到，在同等條件下，KM小鼠血清補(bǔ)體活力明顯低于♂C57BL/6和♂ BALB/c小鼠血清補(bǔ)體活力。KM小鼠品系是我國科研工作者引進(jìn)瑞士種小鼠培育而成，而文獻(xiàn)報(bào)道瑞士種小鼠血清補(bǔ)體活力明顯低于 BALB/c等品系小鼠［9－10］。因此，本方法測得的不同小鼠品系間的血清補(bǔ)體活力高低結(jié)果也從小鼠品系來源上得到了印證。同時(shí)，從本結(jié)果中還可看出，本實(shí)驗(yàn)中使用的3個(gè)小鼠品系，尤其是C57BL/6和BALB/c小鼠，其♀鼠的血清補(bǔ)體活性顯著低于♂鼠的血清補(bǔ)體活性。國外也報(bào)道了BALB/c小鼠和Swiss小鼠的雜交后代中♂小鼠的血清補(bǔ)體活性明顯高于♀小鼠［9－10］。這一結(jié)果提示，在應(yīng)用小鼠模型進(jìn)行補(bǔ)體相關(guān)疾病和免疫損傷的研究時(shí)，也應(yīng)注意到在補(bǔ)體活性上存在的性別差異。

Fig 1 Hemolytic activity of the alternative pathway of serum complement from three mouse strains(n=3)

Fig 2 Serum complement activity in mice after a single i.v.injection of anticomplementary protein

本文采用CVF構(gòu)建了簡便、靈敏、微量、實(shí)用的小鼠血清補(bǔ)體替代途徑溶血活性測定的新方法，為小鼠血清補(bǔ)體活性的測定提供了有效實(shí)用的技術(shù)方法和有益的參考。

［1］ Dunkelberger J R，Song W C.Complement and its role in innate and adaptive immune responses［J］.Cell Res，2010，20(1):34－50.

［2］ Sarma J V，Ward P A.The complement system［J］.Cell Tissue Res，2011，343(1):227 －35.

［3］ Stoermer K A，Morrison T E.Complement and viral pathogenesis［J］.Virology，2011，411(2):362 －73.

［4］ Wagner E，F(xiàn)rank M M.Therapeutic potential of complement modulation［J］.Nat Rev Drug Discov，2010，9(1):43 －56.

［5］ Ricklin D，Hajishengallis G，Yang K，Lambris J D.Complement:a key system for immune surveillance and homeostasis［J］.Nat Immunol，2010，11(9):785 －97.

［6］ Chen M，Daha M R，Kallenberg C G.The complement system in systemic autoimmune disease［J］.J Autoimmun，2010，34(3):J276－86.

［7］ Thurman J M，Holers V M.The central role of the alternative complement pathway in human disease［J］.J Immunol，2006，176(3):1305－10.

［8］ Holers V M.The spectrum of complement alternative pathway-mediated diseases［J］.Immunol Rev，2008，223(1):300 －16.

［9］ van Dijk H，Rademaker P M，Willers J M.Estimation of classical pathway of mouse complement activity by use of sensitized rabbit erythrocytes［J］.J Immunol Methods，1980，39(3):257 －68.

［10］ van Dijk H，Rademaker P M，Willers J M.Determination of alternative pathway of complement activity in mouse serum using rabbit erythrocytes［J］.J Immunol Methods，1980，36(1):29 －39.

［11］ Sun Q Y，Chen G，Guo H，et al.Prolonged cardiac xenograft survival in guinea pig-to-rat model by a highly active cobra venom factor［J］.Toxicon，2003，42(3):257 －62.

［12］孫黔云，王婉瑜，熊郁良.眼鏡蛇毒高活性抗補(bǔ)體因子的體外溶血活性研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2003，19(8):909－13.

［12］ Sun Q Y，Wang W Y，Xiong Y L.In vitro hemolyzation of a highly active anticomplement factor from the venom of Naja kaouthia［J］.Chin Pharmacol Bull，2003，19(8):909 －13.

［13］ Sun Q Y，Bao J.Purification，cloning and characterization of a metalloproteinase from Naja atra venom［J］.Toxicon，2010，56(8):1459－69.

［14］閆銀萍，孫黔云.烙鐵頭蛇毒中一個(gè)具有抗補(bǔ)體活性金屬蛋白酶的純化和性質(zhì)研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(9):1220－5.

［14］ Yan Y P，Sun Q Y.Purification and characterization of a metalloproteinase with anticomplementary activity from Trimeresurus mucrosquamatus venom［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(9):1220－5.