何道輝，趙杰才

廣東省東莞市大朗醫(yī)院骨科，廣東東莞 523770

骨肉瘤（osteosarcom）是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，血運(yùn)豐富，發(fā)展迅速，可早期通過血行轉(zhuǎn)移，尤其是肺轉(zhuǎn)移，給治療帶來極大困難。研究表明，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR-2）在骨肉瘤中高表達(dá)，小窩蛋白-1（caveolin-1）高度表達(dá)在低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞中。但是，caveolin-1在VEGF調(diào)控的腫瘤血管生成中的具體作用及機(jī)制尚待深入研究。本實(shí)驗(yàn)以骨肉瘤細(xì)胞株（SOSP-9607）為細(xì)胞模型，研究caveolin-1對VEGF孵育的SOSP-9607細(xì)胞株的VEGFR-2在信使核糖核酸（mRNA）及蛋白水平表達(dá)的影響，為臨床選擇合適的靶點(diǎn)治療骨肉瘤的血管生成提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SOSP-9607細(xì)胞株購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；Roswell Park Memorial Institute-1640（RPMI 1640）培養(yǎng)基購于 Gibco-BRL公司，按說明書配制，4℃保存；特級胎牛血清購于以色列Kibbutz Beit Haemek公司，分裝，-20℃保存；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）試劑盒購于Fermentas公司，引物由廣州瑞真生物技術(shù)有限公司合成；caveolin-1小片段干擾核糖核酸（siRNA）由廣州復(fù)能基因公司合成、篩選；caveolin-1、VEGFR-2（兔抗人）一抗購于美國Sigma公司，二抗（山羊抗兔）購于廣州美津生物公司。其余試劑由本實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

SOSP-9607細(xì)胞按106個(gè)/ml接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中，37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3～4天換液一次。當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增鋪滿80%時(shí)，以5×105個(gè)/ml的密度進(jìn)行傳代培養(yǎng)。使用廣州復(fù)能基因公司構(gòu)建的caveolin-1 siRNA慢病毒載體及相應(yīng)包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)毒，收集并濃縮病毒液，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂貌《疽焊腥維OSP-9607細(xì)胞，獲得caveolin-1表達(dá)抑制型細(xì)胞。分別對caveolin-1表達(dá)抑制型細(xì)胞和正常SOSP-9607細(xì)胞使用含有25 ng/ml VEGF的RPMI 1640培養(yǎng)基孵育30 min，獲得VEGF+caveolin-1 siRNA組和VEGF組細(xì)胞。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）

按Trizol試劑說明書提取細(xì)胞RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明進(jìn)行操作得到cDNA。設(shè)計(jì)引物序列見表1，由廣州瑞真生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性 60 s，60℃退火 60 s，72℃延伸 60 s；34 個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物，應(yīng)用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成相系統(tǒng)掃面并進(jìn)行灰度分析。

表1 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物設(shè)計(jì)和產(chǎn)物長度

1.4 Western Blotting檢測caveolin-1、VEGFR-2蛋白水平的表達(dá)

在培養(yǎng)皿中加入裂解緩沖液含有50 mM Tris·Cl（pH 8.0）、150 mM NaCl、0.02%NaN3、0.1%十二烷基硫酸鈉（SDS）、100 μg/ml苯甲基磺酰氟（PMSF）、1μg/mlAprotinin、1%Triton100，冰浴20 min，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞裂解物，4℃12000 r/min離心10 min，上清液為裂解后產(chǎn)生的蛋白。加入等體積的2×SDS凝膠上樣緩沖液，煮沸5 min，12000 r/min離心2 min，取上清液進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠（SDS-PAGE）電泳。依次經(jīng)電泳、電轉(zhuǎn)、洗膜、封閉、一抗（1∶1000）37℃孵育、洗膜、二抗（1∶1000）37℃孵育、洗膜、顯影、定影、掃描及灰度分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組樣本均數(shù)間的比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SOSP-9607細(xì)胞中 caveolin-1、VEGFR-2 mRNA水平的表達(dá)

RT-PCR檢測 caveolin-1、VEGFR-2 mRNA水平的表達(dá)，結(jié)果顯示：與對照組相比，VEGF組細(xì)胞caveolin-1 mRNA表達(dá)增加（P＜0.01），VEGFR-2 mRNA 表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；與對照組相比，VEGF+caveolin-1 siRNA組細(xì)胞caveolin-1 mRNA 表達(dá)減少，而 VEGFR-2 mRNA 表達(dá)增加（P＜0.05），與VEGF 組差異不大（P＞0.05）。 見圖 1、2（圖 1為反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2為各實(shí)驗(yàn)組VEGFR或caveolin-1信使核糖核酸表達(dá)水平與β-actin表達(dá)水平的相對值）。

圖1 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測小窩蛋白-1、血管內(nèi)皮生長因子受體-2信使核糖核酸

圖2 小窩蛋白-1、血管內(nèi)皮生長因子受體-2信使核糖核酸表達(dá)水平

2.2 SOSP-9607細(xì)胞中caveolin-1、VEGFR-2蛋白水平的表達(dá)

與對照組比較，VEGF組細(xì)胞caveolin-1、VEGFR-2蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.01），VEGF+caveolin-1 siRNA 組細(xì)胞caveolin-1蛋白表達(dá)減少，且VEGFR-2蛋白水平表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3、4（圖3為聚丙烯酰氨凝膠電泳圖；圖4為各實(shí)驗(yàn)組VEGFR或caveolin-1蛋白質(zhì)表達(dá)水平與β-actin表達(dá)水平的相對值）。

3 討論

骨肉瘤常見于20～30歲年輕人，是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤。腫瘤的血管生成對腫瘤的生長和增殖是必不可少的，同時(shí)對腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移亦起著重要作用。因此，研究腫瘤血管生成并阻斷它已成為世界上治療腫瘤的新熱點(diǎn)[1]。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，VEGF在腫瘤血管生成中處于核心地位，是目前已知活性最強(qiáng)、專屬性最高的腫瘤血管生長誘導(dǎo)劑，其他血管生成因子的作用大多通過增強(qiáng)VEGF的表達(dá)而間接實(shí)現(xiàn)的。Fontanini等[2]發(fā)現(xiàn)，大量的新生血管可促進(jìn)骨肉瘤癌前病變的進(jìn)一步發(fā)展，侵襲性增強(qiáng)。而且，VEGF的受體VEGFR-1、VEGFR-2也在骨肉瘤中高表達(dá)，與骨肉瘤患者的臨床特征和預(yù)后關(guān)系密切[3-4]。盡管如此，但在VEGF刺激下的腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中由VEGFR介導(dǎo)血管生成的分子機(jī)制仍然知之甚少。

caveolin-1是caveolae（小窩）的重要結(jié)構(gòu)蛋白，參與了caveolae的形成以及細(xì)胞增殖、分化、凋亡和血管生成的信號通路的調(diào)控，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。Yang等[5]研究了大鼠原發(fā)性前列腺癌及轉(zhuǎn)移性前列腺癌的多個(gè)癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)在大鼠正常前列腺上皮細(xì)胞中caveolin-1表達(dá)微弱；在原發(fā)性前列腺癌細(xì)胞中其表達(dá)加強(qiáng)、呈胞漿彌漫性；在轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞中，其表達(dá)更強(qiáng)，呈濃集顆粒狀。同樣，在正常人前列腺上皮細(xì)胞中caveolin-1表達(dá)亦呈陰性，而在原發(fā)性前列腺癌細(xì)胞中偶見顆粒狀濃集表達(dá)。其他如腎癌、膀胱癌中caveolin-1也表達(dá)增高，提示caveolin-1增高與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[6]。Horiguchi等[7]發(fā)現(xiàn)在腎透明細(xì)胞癌中，caveolin-1表達(dá)明顯增加，特別是轉(zhuǎn)移性腫瘤、低分化腫瘤和有血管侵襲的腫瘤。Joo等[8]也在腎透明細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)caveolin-1可以促進(jìn)腫瘤微血管生成。

本研究中RT-PCR和Western Blot結(jié)果均發(fā)現(xiàn)siRNA沉默骨肉瘤細(xì)胞株SOSP-9607中的caveolin-1表達(dá)可以降低VEGF對VEGFR-2的刺激作用，并對VEGFR-2mRNA的表達(dá)影響不大，而對其蛋白水平的表達(dá)有影響，提示caveolin-1在VEGF刺激骨肉瘤細(xì)胞株SOSP-9607 VEGFR-2表達(dá)的信號中可能起著關(guān)鍵作用，并有可能是通過蛋白水平的調(diào)控發(fā)揮作用。

綜上所述，骨肉瘤的生長和轉(zhuǎn)移均是血管生成依賴性的，抑制骨肉瘤的血管生成從而阻斷骨肉瘤的營養(yǎng)供給和轉(zhuǎn)移途徑可望成為治療骨肉瘤的新策略。本實(shí)驗(yàn)為臨床選擇合適的靶點(diǎn)治療抑制骨肉瘤的血管生成提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]吳朝陽,林建華.抑制血管生成治療骨肉瘤的研究進(jìn)展[J].中國骨腫瘤骨病,2007,12(6):370-376.

[2]Fontanini G,Vignati S,Bigini D,et al.Neoangiogenesis:a putative marker of malignancy in non-small-celllungcancer(NSCLC)development[J].Int J Cancer,1996,67(5):615-619.

[3]李永昊,肖玉周,汪萬英.VEGF及KDR在骨肉瘤中的表達(dá)及其臨床意義[J].解剖與臨床,2008,13(1):27-31.

[4]沙丹,何友兼.VEGF及其受體Flt-1、KDR在鼻咽癌組織中的表達(dá)及意義[J].癌癥,2006,25(2):229-234.

[5]Yang G,Timme TL,Frolov A,et al.Combined C-Myc and caveolin-1 expression in human prostate carcinoma predicts prostate carcinoma progression[J].J Cancer,2005,103(6):1186-1194.

[6]Salahaldin A,Timothy C.Caveolin-1 regulates VEGF-stimulated angiogenic activities in prostate cancer and endothelial cells[J].Cancer Biol Ther,2009,8(23):2286-2296.

[7]Horiguchi A,Asano T,Asakuma J,et al.Impact of caveolin-1 expression on clinical pathological paramet ers in renal cell carcinoma[J].J Urol,2004,172(2):718-722.

[8]Joo HJ,Oh DK,Kim YS,et al.Increased expression of caveolin-1 and microvessel density correlates with metastasis and poor prognosis in clear cell renal cell carcinoma[J].BJU Int,2004,93(3):291-296.