高燕會(huì)，樊民亮，駱文堅(jiān)，黃華宏，童再康

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 生物技術(shù)研究所，浙江 臨安 311300；2.浙江省林業(yè)種苗管理總站，浙江 杭州 310020）

金錢松Pseudolarix amabilis又名金松，是中國(guó)特有的單種屬植物。地質(zhì)年代的白惡紀(jì)金錢松曾經(jīng)在亞洲、歐洲、美洲都有分布，更新世的冰河時(shí)代各地金錢松都相繼滅絕，唯有中國(guó)長(zhǎng)江中下游殘留少數(shù)，成為現(xiàn)今僅存于中國(guó)的單屬單種特有的植物［1－4］。由于其特殊的分類地位，金錢松在裸子植物松科Pinaceae系統(tǒng)發(fā)育、古生態(tài)和古氣候的研究方面具有重要意義。這一寶貴的植物遺產(chǎn)被中國(guó)定為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物，分布于江蘇、安徽、浙江、江西、湖南等地，喜光愛(ài)肥，適宜酸性土壤。金錢松樹干通直，材性優(yōu)良，紋理直，耐水濕，可供建筑、橋梁、船舶及家具等用材，而且樹形優(yōu)美，秋季葉呈金黃色，是優(yōu)良的綠化和庭院觀賞樹種。種子可榨油，樹皮和根皮（中藥名為土槿皮或土荊皮）有止癢殺蟲的功能，外用于治療手腳癬、神經(jīng)性皮炎、濕疹［5－6］等。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)金錢松的研究多集中在生物學(xué)和生理學(xué)特征方面［7］，例如葉表皮的掃描電鏡觀察［8］、 種子品質(zhì)［9］、 栽培繁殖技術(shù)［10－11］、 生長(zhǎng)情況［11］、 化學(xué)成分研究［12］。也有研究金錢松細(xì)胞分類學(xué)的報(bào)道，認(rèn)為根據(jù)其核型分析，應(yīng)該單獨(dú)建立一個(gè)金錢松亞科［13－14］。零星的還有組織培養(yǎng)［15］的報(bào)道。而對(duì)金錢松遺傳多樣性的研究報(bào)道較少。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（radom amplified polymorphic DNA，RAPD）分子標(biāo)記技術(shù)操作簡(jiǎn)單易行，具有多態(tài)性高，無(wú)需活材料，能實(shí)現(xiàn)全基因組無(wú)偏取樣和無(wú)組織特異性等，在瀕危植物遺傳變異方面有較為廣泛的應(yīng)用［16－18］。此外，還廣泛地應(yīng)用于松類植物遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究中，如多脂松Pinus resinosa，歐洲赤松Pinus sylvestris，輻射松 Pinusradiata，紅松 Pinuskoraiensis，黃山松 Pinustaiwanensis，馬尾松 Pinusmassoniana 等樹種［19－24］。本研究采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)浙江省內(nèi)不同來(lái)源的金錢松遺傳多樣性進(jìn)行研究，旨在為合理地保護(hù)、利用與開發(fā)金錢松遺傳資源提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料采自浙江省安吉縣靈峰寺林場(chǎng)，共9個(gè)來(lái)自金錢松天然林的62個(gè)單株（表1），采集葉芽，于－70℃的低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金錢松基因組DNA的提取 金錢松基因組DNA的提取采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）-硅珠法［25］。

1.2.2 金錢松隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RAPD-PCR）擴(kuò)增體系的建立［25－27］針對(duì)Taq DNA聚合酶量，鎂離子（Mg2+），模板DNA，三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs）和引物，采用5因子4水平的正交設(shè)計(jì)L16（45）設(shè)計(jì)方案詳（表2）進(jìn)行試驗(yàn)，共16個(gè)處理，重復(fù)2次·處理－1，在Gene Amp PCR System 9700擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RAPD-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 min，38個(gè)PCR循環(huán)（94℃變性30 s，38℃退火30 s，72℃延伸2 min），72℃延伸7 min。擴(kuò)增的反應(yīng)產(chǎn)物用10.0 g·kg－1的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，于Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

表1 供試材料編號(hào)及其來(lái)源Table 1 Code and source of the materials investigated

表2 PCR擴(kuò)增體系各成分因素-水平正交設(shè)計(jì)表L16（45）Table 2 Orthoronal design for PCR

1.2.3 不同退火溫度的梯度試驗(yàn) 用以上處理?xiàng)l件所得到的最佳反應(yīng)體系進(jìn)行退火溫度梯度試驗(yàn)，設(shè)置退火溫度。在PCR Express（HyBAID）擴(kuò)增儀上自動(dòng)生成12個(gè)溫度梯度：30.0，30.3，30.9，31.8，32.9，34.7，35.5，36.9，38.4，39.3，39.8，40.1℃，比較退火溫度對(duì)電泳譜帶的清晰度和數(shù)量的影響，從而確定最佳退火溫度。

1.2.4 引物篩選 引物篩選包括初篩和復(fù)篩。用1個(gè)樣品對(duì)200個(gè)隨機(jī)引物進(jìn)行初篩，選擇譜帶清晰的引物用于復(fù)篩。復(fù)篩時(shí)用4個(gè)不同種源各1個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，選擇出清晰、多態(tài)性較高的引物用于RAPD-PCR擴(kuò)增。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)金錢松62個(gè)單株進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增的電泳譜帶總條數(shù)和多態(tài)性條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。根據(jù)分子標(biāo)記在相同電泳遷移率的有無(wú)統(tǒng)計(jì)得到所有位點(diǎn)的二元數(shù)據(jù)；有DNA擴(kuò)增有帶記為1，無(wú)帶記為0，強(qiáng)帶和可分辨的弱帶賦值為1。擴(kuò)增條帶與標(biāo)準(zhǔn)分子量的遷移率相比對(duì)照，相同引物擴(kuò)增出來(lái)的同一長(zhǎng)度（同一電泳遷移率）的帶視為同一位點(diǎn)。將得到的二元數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，并計(jì)算其歐氏遺傳距離，按Average Linkage對(duì)金錢松種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，建立聚類樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 金錢松RAPD-PCR最佳反應(yīng)體系的建立

2.1.1正交試驗(yàn)的直觀分析 根據(jù)本試驗(yàn)的正交設(shè)計(jì)進(jìn)行PCR的擴(kuò)增結(jié)果和電泳檢測(cè)，依據(jù)瓊脂糖電泳條帶的強(qiáng)弱和雜帶的多少做直觀分析。正交試驗(yàn)設(shè)PCR擴(kuò)增結(jié)果是由鎂離子（Mg2+），dNTPs，引物，Taq DNA聚合酶和模板DNA等因素綜合作用的結(jié)果，因而擴(kuò)增結(jié)果存在明顯差異。第1，2，3，4組合譜帶較弱，其原因可能是由于TaqDNA聚合酶的濃度太低而引起的；由于TaqDNA聚合酶的濃度一定時(shí)，鎂離子（Mg2+）濃度的過(guò)低（第5，6，9，10組合擴(kuò)增不出條帶），而鎂離子（Mg2+）濃度過(guò)高（第8組合擴(kuò)增條帶拖尾且模糊）會(huì)影響擴(kuò)增的效果，第7組合條帶清晰且多態(tài)性高；當(dāng)Taq DNA聚合酶和鎂離子（Mg2+）濃度濃度升高時(shí)，會(huì)擴(kuò)增出非特異性條帶（如第11，12組合）。通過(guò)多因素綜合比較選擇第7組合（1.0 × 16.67 nkat TaqDNA 聚合酶，2.5 mmol·L－1鎂離子（Mg2+），50 ng 模板DNA，0.1 mmol·L－1dNTPs，0.5 μmol·L－1引物）擴(kuò)增的譜帶不但多態(tài)性好，重復(fù)性好，且譜帶清晰，是金錢松RAPD-PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系。

2.1.2 金錢松RAPD-PCR最佳退火溫度的確定 退火溫度是影響PCR的重要因素之一。退火溫度不僅與引物序列有關(guān)，還與物種DNA的序列密切相關(guān)［28］，因此，確定最佳退火溫度對(duì)獲得穩(wěn)定可靠的ISSRPCR結(jié)果非常重要。金錢松RAPD-PCR溫度梯度PCR的電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，在12個(gè)溫度梯度下30.0，30.3，30.9，31.8，32.9和34.7℃擴(kuò)增的條帶較弱，不能正確地表達(dá)其引物的多態(tài)性，35.5，36.9和38.4℃引物擴(kuò)增出清晰明亮的RAPD條帶。39.3，39.8和40.1℃溫度過(guò)高時(shí)，擴(kuò)增出的條帶有拖尾，所以退火溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響到PCR擴(kuò)增條帶的清晰度和多態(tài)性的正確表達(dá)，綜合多方面的因素，最終選擇38.0℃為金錢松RAPD-PCR擴(kuò)增最適宜的退火溫度。

2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

通過(guò)初篩和復(fù)篩共得到的18條多態(tài)性引物（表3），18條RAPD引物對(duì)62個(gè)供試材料進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出172條帶，其中170條帶具有遺傳多態(tài)性，多態(tài)性比率為99.2%。在62個(gè)供試材料中，不同RAPD引物的總位點(diǎn)差異較大，從3～20條不等，平均為9.56條，擴(kuò)增出的DNA片段大小分布為200～3 000 bp；其中擴(kuò)增條帶數(shù)最多的為引物S53，共擴(kuò)增出20條帶，說(shuō)明不同引物與供試材料總DNA部分區(qū)域的同源性有較大差異。可以說(shuō)明：金錢松種子園群體內(nèi)的DNA多態(tài)性是很豐富的，遺傳變異幅度很大，可能與野生類群分布大范圍較廣，分布區(qū)內(nèi)環(huán)境復(fù)雜多樣有關(guān)，也可能同其復(fù)雜的遺傳背景與起源有關(guān)，因而這些豐富的變異類型為選育觀賞新品種奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖1 正交試驗(yàn)PCR產(chǎn)物電泳圖Figure 1 Theelectrophoresis map of PCR products of the orthogonal tests

表3 18個(gè)引物擴(kuò)增出DNA片段數(shù)Table 3 DNA fragments amplified with 18 primers

2.3 聚類分析

將18條引物擴(kuò)增后得到的二元數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，對(duì)供試材料根據(jù)RAPD標(biāo)記歐氏遺傳距離，按Average Linkage對(duì)62份金錢松種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，建立聚類樹狀圖（圖2）。由圖2中以看出，利用RAPD分子標(biāo)記的結(jié)果可以將62份金錢松種質(zhì)資源聚為三大類群：第一大類群是包括由采集于安吉大、安吉三川林場(chǎng)、安吉章村、安吉大溪以及安吉姚村的不同材料，第二大類包括采自長(zhǎng)興、臨安以及嘉興的材料，第三大類包括采自安吉上市鄉(xiāng)的材料，其中，同一來(lái)源的材料幾乎都聚在一起，說(shuō)明金錢松天然群體RAPD的多態(tài)性分類和金錢松的地理分布有一定的關(guān)系。但也有例外，如來(lái)自臨安野生種群的17號(hào)和來(lái)自長(zhǎng)興野生種群的16號(hào)就分別和來(lái)自安吉大的野生種群聚在一起，可能是遺傳變異的結(jié)果；來(lái)自安吉大溪的39號(hào)較為特殊，與其他個(gè)體的遺傳距離為0.280 0～1.255 7，表明金錢松天然種群內(nèi)存在較高的的遺傳多樣性。

3 討論

3.1 金錢松遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是指種內(nèi)基因的變化，包括種內(nèi)不同的種群間和同一種群內(nèi)個(gè)體的遺傳變異，種內(nèi)多樣性是物種及以上各水平多樣性的最重要來(lái)源。遺傳變異、生活史特點(diǎn)、種群動(dòng)態(tài)及其遺傳結(jié)構(gòu)等決定或影響著一個(gè)物種與其他物種及其環(huán)境相互作用的方式，而且種內(nèi)的多樣性是一個(gè)物種對(duì)人類影響進(jìn)行反應(yīng)的決定因素。種內(nèi)的遺傳多樣性多發(fā)生在分子水平，并且都與核酸的理化性質(zhì)緊密相關(guān)，新的變異是突變的結(jié)果［29］。

瀕危植物的遺傳多樣性水平一般較低。本研究通過(guò)RAPD技術(shù)研究了浙江省內(nèi)的金錢松的多態(tài)性位點(diǎn)的比率是99.2%，這一結(jié)果表明：分布于浙江省的金錢松居群具有較為豐富的種內(nèi)遺傳多樣性，這與劉建鋒等［16－17］對(duì)瀕危植物崖柏Thuja sutchuenensis的遺傳多樣性的研究結(jié)論相一致：瀕危植物遺傳多樣性具有一定的變化范圍。說(shuō)明并非所有的珍稀瀕危植物都存在低水平的遺傳多樣性。

本研究通過(guò)RAPD分子標(biāo)記得到的金錢松的聚類圖中，同一來(lái)源的材料幾乎都聚在一起，但也有個(gè)別的材料和其地理分布并不完全相同，如來(lái)自臨安的17號(hào)、來(lái)自長(zhǎng)興的16號(hào)以及來(lái)自安吉大溪的39號(hào)，這可能是由于不同地理?xiàng)l件的環(huán)境因素或者是由于種群內(nèi)的基因突變所引起的，這些突變經(jīng)自然選擇一些中性突變通過(guò)隨機(jī)過(guò)程整合到基因組中，即可形成豐富的分子水平豐富的遺傳多樣性。

3.2 金錢松種質(zhì)資源的保護(hù)策略

造成金錢松瀕危的原因主要有：一是殘存的個(gè)體稀少，分布零星，加上人為破壞，使其生存環(huán)境受到嚴(yán)重威脅，資源日漸減少；二是金錢松結(jié)實(shí)有大小年之分，一般3～5 a豐產(chǎn)1次，對(duì)其大量繁殖有明顯地影響。

本研究中，金錢松的遺傳多樣性非常豐富，能為植物遺傳改良提供理論指導(dǎo)。通過(guò)對(duì)金錢松種子園的遺傳結(jié)構(gòu)分析可以獲得群體遺傳多樣性、遺傳變異分布式樣等方面的重要數(shù)據(jù)，對(duì)實(shí)現(xiàn)物種的有效管理和制定合理的保護(hù)策略有重要參考價(jià)值［29－30］。因此，結(jié)合金錢松的群體遺傳多樣性，對(duì)現(xiàn)存的金錢松種質(zhì)資源采取就地保存策略時(shí)，重視大范圍群體內(nèi)不同類型個(gè)體的保存，盡可能防止人為破壞帶來(lái)的遺傳資源的流失。另一方面，由于浙江省內(nèi)金錢松的遺傳多樣性較豐富，因此，在對(duì)金錢松種質(zhì)資源實(shí)施保存時(shí)，不能僅考慮到群體內(nèi)不同個(gè)體的保存，同時(shí)也應(yīng)對(duì)不同地理區(qū)域的群體進(jìn)行保存，可以進(jìn)行遷地保護(hù)［32］，盡可能多地收集其他地區(qū)的金錢松種質(zhì)材料，建立種質(zhì)資源庫(kù)。本研究即是通過(guò)對(duì)建立浙江省安吉縣靈峰寺林場(chǎng)的金錢松的種子園，可以為此加大種群間的交換，為基因交流和重組創(chuàng)造條件，以保存孑遺金錢松的遺傳多樣性和金錢松的種質(zhì)資源。

圖2 金錢松種質(zhì)資源聚類圖Figure 2 Dendrogram of Pseudolarix amabilis germ plasm resource

［1］李楠.世紀(jì)論松科植物的地理分布、起源和擴(kuò)散［J］.植物分類學(xué)報(bào)，1995，33（2）：105－130.LI Nan.Studies on the geographic distribution,origin and dispersal of the family Pinaceae Lindl.［J］.Acta Phytotaxon Sin，1995，33（2）：105－130.

［2］應(yīng)俊生.中國(guó)裸子植物分布區(qū)的研究（1）松科植物的地理分布［J］.植物分類學(xué)報(bào)，1989，27（1）：27－38.YING Junsheng.Areography of the gymnosprerms of China（1）distribution of the Pinaceae of China ［J］.Acta Phytotaxon Sin，1989，27（1）：27－38.

［3］王冬，梁鵬，劉曉菊.金錢松高效栽培技術(shù)［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（3）：57.WANG Dong，LIANG Peng，LIU xiaoju，The high effect cultivation techniques of Pseudolarix amabilis（Nelson）Rehd.［J］.Mod Agric Technol，2009（3）：57.

［4］姚志剛，陳玉清.櫸樹和金錢松在江蘇的資源及保護(hù)［J］.林業(yè)科技開發(fā)，2001，15（6）：16－18.YAO Zhigang，CHEN Yuqing.Resources and protection for Zelkova and Pseudolarix amabilis（Nelson） Rehd.［J］.China For Sci Technol，2001，15（6）：16－18.

［5］王章榮，陳天華，黎章矩，等.金錢松遺傳資源調(diào)查收集與研究利用［J］.南京林學(xué)院學(xué)報(bào)，1985（2）：47－52.WANG Zhangrong,CHEN Tianhua,LI Zhangju，et al.Genetic resources exploration and research utilization of Pseudolarix amabilis（Nelson） Rehd.［J］.J Nanjing For Coll，1985（2）：47－52.

［6］吳征鎰.新華本草綱要：第1冊(cè)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1988.

［7］魏學(xué)智，胡玉熹，林金星，等.中國(guó)特有植物金錢松的生物學(xué)特性及其保護(hù)［J］.武漢植物學(xué)研究，1999，17（增刊）：73－77.WEI Xuezhi，HU Yuxi，LIN Jingxing，et al.The biology and concervation of pseudolarix amabilis（Nelson） Rehd.［J］.J Wuhan Bot Res，1999，17（supp）：73－77.

［8］邵鄰相，張鳳娟.6種松科植物葉表皮的掃描電鏡觀察［J］.植物研究，2005，25（3）：281－285.SHAO Lingxiang，ZHANG Fengjuan.Sem observation on leaf epidermis of 6 species in Pinaceae ［J］.Bull Bot Res，2005，25（3）：281－285.

［9］喻方圓，錢錦.不同采種期金錢松種子品質(zhì)的研究［J］.中南林學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，19（4）：45－47.YU Fangyuan，QIAN Jin.a seed quality study of Pseudolarix amabilis in different collection periods ［J］.J Cent South For Univ，1999，19（4）：45－47.

［10］錢洪濤，張紀(jì)林，宋建法，等.金錢松幼苗移植措施對(duì)生長(zhǎng)的影響［J］.林業(yè)科技開發(fā)，2005，19（3）：59－60.QIAN Hongtao，ZHANG Jilin，SONG Jianfa，et al.The effect on growth of Pseudolarix amabilis by seedling transplant measures ［J］.China For Sci Technol，2005，19（3）：59－60.

［12］劉洪亮，何承忠.金錢松化學(xué)成分及生物活性研究現(xiàn)狀與展望［J］.西南林學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，28（1）：52－56.LIU Hongliang,HE Chengzhong.Research status and prospect of the chemical constituents and bioactivities of Pseudolarix kameferi［J］.J Southwest For Coll，2008，28（1）：52－56.

［13］ 李林初.金錢松（屬）的細(xì)胞分類學(xué)研究［J］.云南植物研究，1994，16（3）：248-254.LI Linchu.A cytotaxonomical study on Pseudolarix kameferi［J］.Acta Bot Yunnan，1994，16（3）：248-254.

［14］吳文珊，張清其，劉劍秋.金錢松染色體核型的研究［J］.福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，12（1）：81－83.WU Wenshan，ZHANG qingqi，LIU Jianqiu.Karyotype studies of Pseudolarix amabilis ［J］.J Fujian Teach Univ Nat Sci，1996，12（1）：81－83.

［15］何子燦，柯善強(qiáng)，桂耀林，等.外源激素對(duì)金錢松胚外植體愈傷組織的誘導(dǎo)及其器官發(fā)生的調(diào)節(jié)作用［J］.武漢植物學(xué)研究，1995，13（1）：81－86.HE Zicang，KE Shanqiang,GUI Yaolin，et al.Influence of plant growth regulators on the in vitro organogenesis of Pseudolarix amabilis embryo explants ［J］.J Wuhan Bot Res，1995，13（1）：81－86.

［16］劉建鋒，肖文發(fā).瀕危植物崖柏遺傳多樣性的RAPD分析［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（1）：68－72.LIU Jianfeng,XIAO Wenfa.RAPD analysis of the genetic diversity of a critically endangered plant，Thuja sutchuenensis（Cupressaceae）［J］.Acta Agric Univ Jiangxi，2008，30（1）：68－72.

［17］李建輝，金則新，李鈞敏.瀕危植物長(zhǎng)葉榧群體遺傳多樣性的RAPD分析［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，18（12）：2661－2667.LI Jianhui,JIN Zexin,LI Junmin,et al.Genetic diversity of endangered plant Torreya jackii：a study with RAPD markers ［J］.Chin J Appl Ecol，2007，18（12）：2661－2667.

［18］曹福亮，花吉吉斌，汪貴斌，等.野生銀杏資源群體遺傳多樣性的RAPD分析［J］.浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，25（1）：22－27 CAO Fuliang，HUA Zhebin，WANG Guibin，et al.Genetic diversity in wild populations of Ginkgo biloba using random amplified polymorphic DNA（RAPD） analysis ［J］.J Zhejiang For Coll，2008，25（1）：22－27.

［19］ MOSSCLCR A,EGGER K N，HUGHCS G A.Low levels of genetic diversity in red pine confirmed by random amplitied polymorphic DNA markers ［J］.Can J For Res，1992，22：1332－1337.

［20］ SZMIDT A E，WANG Xiaoru，LU Mengzhu.Empirical assessment of allozyme and RAPD variation in Pinus sylvestris（L.）using haploid tissue analysis ［J］.Heredity，1996，76：412－420.

［21］ HONG Y P,HIPKINS V D,STRAUSS S H.Chloroplast DNA diversity among trees，populations and species in the California closed-cone pines（Pinus radiata，P.miuricata and P.attanuata） ［J］.Genetics，1993，135：1187－1196.

［22］夏銘，周曉峰，趙士洞.天然紅松群體遺傳多樣性的RAPD分析［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2001，21（5）：730－737.XIA Ming,ZHOU Xiaofeng,ZHAO Shidong.RAPD analysis on genetic diversity of natural populations of Pinus koraiensis ［J］.Acta Ecol Sin，2001，21（5）：730－737.

［23］唐娟娟，范義榮，朱睦元.黃山松群體遺傳多樣性分析［J］.浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，20（1）：23－26.TANG Juanjuan，F(xiàn)AN Yirong，ZHU Muyuan.Analysis of the genetic diversity of Pinus taiwanensis populations ［J］.J Zhejiang For Coll，2003，20（1）：23－26.

［24］李丹，彭少麟.3個(gè)不同海拔梯度馬尾松種群的遺傳多樣性及其與生態(tài)因子的相關(guān)性［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2001，21（3）：415－421.LI Dan，PENG Shaolin.Genetic diversity in three Pinnus massoniana populations in different elevations and its relationship with ecological factors ［J］.Acta Ecol Sin，2001，21（3）:415－421.

［25］高燕會(huì)，朱玉球，黃華宏，等.楊梅RAPD-PCR體系的正交優(yōu)化研究 ［J］.生物技術(shù)，2006，16（3）：55－58.GAO Yanhui，ZHU Yuqiu，HUANG Huahong，et al.Study on optimization of RAPD-PCR reaction system of Myrica rubra using orthogonal design ［J］.Biotechnology，2006，16（3）：55－58.

［26］張雷凡，高燕會(huì)，朱玉球，等.石蒜屬植物種質(zhì)資源ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立［J］.浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，24（2）：156－161 ZHANG Leifan，GAOyanhui，ZHU Yuqiu，et al.An inter simple sequence repeats（ISSR） reaction system for Lycoris（Amaryllidaceae） ［J］.J Zhejiang For Coll，2007，24（2）：156－161.

［27］李慧慧，朱玉球，斯金平，等.栝樓ISSR-PCR體系的正交優(yōu)化［J］.生物技術(shù)，2009，19（6）：38－41.LI Huihui，ZHU Yuqiu，SI Jinping，et al.Establishment of ISSR reaction system of Trichosanthes kirilowii Maxim［J］.Biotechnology，2009，19（6）：38－41.

［28］殷瑤，谷勇，蔡麗莎，等.淺述生物多樣性的價(jià)值及其保護(hù)［J］.生物學(xué)通報(bào)，2009，44（5）：8－11.YIN Yao，GU Yong，CAI Lisha，et al.The value and protection of biodiversity ［J］.Bull Biol，2009，44（5）：8－11.

［29］歐陽(yáng)志勤，程勤，張興，等.稀有植物云南金錢槭的現(xiàn)狀及保護(hù)措施［J］.林業(yè)調(diào)查規(guī)劃，2007，32（2）：143－145.OUYAN Zhiqin，CHENG Qin，ZHANG Xing，et al.Status of rare Dipteroina dyeriana and counter measure for its protection ［J］.For Invent Plan，2007，32（2）：143－145.

［30］薛達(dá)元，蔣明康，李正方，等.蘇浙皖珍稀瀕危植物保護(hù)規(guī)劃的研究［J］.自然資源學(xué)報(bào)，1992，7（1）：27－34.XUE Dayuan，JIANG Mingkang，LI Zhengfang，et al.A study of the conservation planning for the rare and risk plant species in Jiangsu，Zhejiang and Anhui Provinces ［J］.J Nat Resour，1992，7（1）：27－34.

［31］陳泓，黃仕訓(xùn).廣西熱帶稀有瀕危植物遷地保護(hù)地域探討［J］.廣西植物，2006，26（6）：670－674.CHEN Hong,HUANG Shixun.Discussion on regions of ex-situ conservation for tropical rare and endangered plants of Guangxi［J］.Guihaia，2006，26（6）：670－674.