(1山東省立醫(yī)院，濟南 250021;2山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

目前對乳腺癌的治療主要采用手術(shù)、化放療等綜合治療。傳統(tǒng)化療藥物多存在選擇性差、毒性作用大、易發(fā)生耐藥等問題。研究開發(fā)新的化療輔助藥物對于提高療效，減輕患者痛苦具有重要意義。人參作為我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有多種生物活性。已證實多種人參皂苷單體如Rh、Rg等均具有抗腫瘤作用，但其確切機制尚未明了。2010年1月～2011年1月，我們觀察了人參皂苷Rg3對雌激素受體(ER)陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231增殖的影響?，F(xiàn)報告如下并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人參皂苷Rg3(中國藥品生物制品檢定所)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(Santa Cruz，USA)，辣根過氧化物酶(HPR)標(biāo)記二抗(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)，DMEM培養(yǎng)基(GIBCO，USA)，胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)。超敏化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(Amersham Biosciences，USA)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 人參皂苷Rg3溶液制備及細胞培養(yǎng) 人參皂苷Rg3干粉用二甲亞砜(DMSO)溶解為100 mg/ml，備用;MDA-MB-231購自上海細胞所，細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml的DMEM培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，生長至80%～90%融合后傳代，隔天換液1次。

1.3 細胞分組及細胞活力檢測 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231，按2 000/孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后加藥。每組設(shè)4個復(fù)孔，分別加入終濃度為50、100、200、400、600 μmol/L 人參皂苷 Rg3(為實驗組)，設(shè)不加藥物的細胞為對照組。采用MTT法測算兩組細胞存活率。兩組分別于孵育24、48、72 h后每孔加MTT(5 g/L)20 μl，繼續(xù)孵育4 h后棄培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μl/孔混勻，酶標(biāo)儀(波長570 nm)測定各孔OD值。細胞存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.4 細胞中Cyclin E及CDC25A檢測 收集兩組細胞，提取總蛋白，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度，按試劑盒說明書操作。取蛋白樣品40 μg，適量上樣緩沖液混勻，100℃變性5 min，用5%積層膠、10%分離膠的SDS-PAGE電泳后，采用Western blot法檢測細胞內(nèi)Cyclin E、CDC25A。用凝膠圖像分析系統(tǒng)對Western blot反應(yīng)陽性條帶進行積分光密度(IOD)測定，以Cyclin E、CDC25A IOD值與對應(yīng)的GAPDH IOD值的比值代表其相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件。計量資料以±s表示，用t檢驗。P≤0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg3對MDA-MB-231細胞存活率的影響 50～200 μmol/L的人參皂苷Rg3，具有促進MDA-MB-231增殖作用，促增殖能力與藥物濃度成正比(P 均 ＜0.01);400～600 μmol/L的人參皂苷Rg3則抑制細胞增殖，其抑制能力與藥物濃度成正比(P均＜0.01)。詳見表1。

表1 實驗組中不同濃度人參皂苷Rg對MDA-MB-231細胞存活率的影響(%，±s)

表1 實驗組中不同濃度人參皂苷Rg對MDA-MB-231細胞存活率的影響(%，±s)

人參皂苷Rg3濃度(μmol/L)MDA-MB-231細胞存活率24 h 48 h 72 h 50 108.65 ±0.92 122.71 ±1.35 141.43 ±1.06 100 115.81 ±1.68 127.45 ±0.71 148.68 ±1.55 200 109.52 ±1.43 123.53 ±1.02 133.68 ±1.84 400 68.13 ±1.76 73.37 ±0.96 80.36 ±1.53 600 57.91 ±2.01 65.25 ±1.78 66.96 ±2.19

2.2 兩組細胞中Cyclin E、CDC25A表達水平比較50～200 μmol/L的人參皂苷Rg3，上調(diào)MDA-MB-231內(nèi)Cyclin E、CDC25A表達，并與其藥物濃度呈正比(P 均 ＜0.01);400～600 μmol/L的人參皂苷Rg3則抑制Cyclin E、CDC25A表達，其抑制能力與藥物濃度成正比(P均＜0.01)。詳見表2。

表2 兩組MDA-MB-231內(nèi)Cyclin E、CDC25A相對表達量比較( ±s)

表2 兩組MDA-MB-231內(nèi)Cyclin E、CDC25A相對表達量比較( ±s)

組別Cyclin E CDC25A對照組1.035 ±0.032 0.511 ±0.017實驗組50 μmol/L 1.078 ±0.049 0.586 ±0.009 100 μmol/L 1.101 ±0.016 0.595 ±0.014 200 μmol/L 1.113 ±0.027 0.597 ±0.011 400 μmol/L 0.644 ±0.037 0.384 ±0.007 600 μmol/L 0.482 ±0.039 0.353 ±0.013

3 討論

已有研究證實，人參皂苷類藥物可以抑制腫瘤細胞生長，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，對化療藥效有增強作用［1］;動物實驗也發(fā)現(xiàn)人參皂苷可以抑制小鼠體內(nèi)卵巢癌的生長和癌細胞增殖［2］。人參皂苷Rg3是一種四環(huán)三萜皂苷，其抗腫瘤作用已經(jīng)引起廣泛重視，但是確切機制尚未明了。

本研究結(jié)果顯示，低濃度(≤200 μmol/L)人參皂苷Rg3，對MDA-MB-231增殖具有促進作用，其促增殖能力與藥物濃度成正比(P均＜0.01);高濃度(≥400 μmol/L)人參皂苷Rg3則抑制細胞增殖，其抑制能力與藥物濃度成正比(P均＜0.01)。對細胞周期相關(guān)蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)，與對照細胞比較，低濃度人參皂苷Rg3可上調(diào)MDA-MB-231內(nèi)Cyclin E、CDC25A表達，高濃度人參皂苷Rg3則抑制Cyclin E、CDC25A表達。人參皂苷 Rg3對 MDA-MB-231細胞內(nèi)Cyclin E、CDC25表達水平的影響與其對細胞存活率的影響趨勢一致，提示Rg3可能通過調(diào)節(jié)細胞周期影響腫瘤細胞的增殖。

Cyclin E主要在細胞G1～S期表達，通過結(jié)合并激活細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK)2，形成Cyclin E-CDK2復(fù)合物，調(diào)節(jié)細胞G1、S期的過渡。Cyclin E過量表達可持續(xù)性激活CDK2，進而促進視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤蛋白磷酸化，細胞發(fā)生異常增殖［3］。目前已經(jīng)在多種類型腫瘤中發(fā)現(xiàn)了 Cyclin E-CDK2的表達異常和功能失調(diào)，表現(xiàn)為Cyclin E的表達與細胞周期不同步，且表達水平顯著高于生理水平［4～6］。通過藥物抑制 Cyclin E的表達，可以造成細胞G1期阻滯，抑制腫瘤細胞增殖。

CDC25A是雙重特異性磷酸酶家族的重要成員，主要在G1中晚期表達，通過催化CDK去磷酸化促使細胞發(fā)生 G1、S轉(zhuǎn)換并進入 S期［7］。CDC25A參與G2、M期轉(zhuǎn)換，是重要的細胞周期調(diào)控因素之一［8］。CDC25A在結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌等腫瘤均呈過度表達，通過抑制CDC25A的表達抑制腫瘤進展是乳腺癌治療的一個新方向［9］。

綜上所述，高濃度人參皂苷Rg3對人乳腺癌MDA-MB-231的增殖具有抑制作用，此作用與影響細胞周期相關(guān)蛋白Cyclin E、CDC25的表達，導(dǎo)致細胞周期停滯于G1或G2期有關(guān)。人參皂苷Rg3的抑瘤作用研究還需利用動物模型進行體內(nèi)實驗，其影響細胞周期調(diào)控的相關(guān)信號通路尚需進一步深入研究。

［1］Jia WW，Bu X，Philips D，et al.Rh2，a compound extracted from ginseng，hypersensitizes multidrug-resistant tumor cells to chemotherapy［J］.Can J Physiol Pharmacol，2004，82(7):437.

［2］Nakata H，Kikuchi Y，Tode T，et al.Inhibitory effects of ginsenoside Rh2 on tumor growth in nude mice bearing human ovarian cancer cells［J］.Jpn J Cancer Res，1998，89(7):733-740.

［3］Dapas B，F(xiàn)arra R，Grassi M，et al.Role of E2F1-Cyclin E1-cyclin E2 circuit in human coronary smooth muscle cell proliferation and therapeutic potential of its downregulation by siRNAs［J］.Mol Med，2009，15(9-10):297-306.

［4］Yasui W，Oue N，Aung PP，et al.Molecular-pathological prognostic factors of gastric cancer:a review［J］.Gastric Cancer，2005，8(2):86-94.

［5］Spruck C，Sun D，F(xiàn)iegl H，et al.Detection of low molecular weight derivatives of cyclin E1 is a function of cyclin E1 protein levels in breast cancer［J］.Cancer Res，2006，66(14):7355-7360.

［6］Akli S，Keyomarsi K.Cyclin E and its low molecular weight forms in human cancer and as targets for cancer therapy［J］.Cancer Biol T-her，2003，2(4 Suppl 1):38-47.

［7］Donzelli M，Draetta GF.Regulating mammalian checkpoints through Cdc25 inactivation［J］.EMBO Rep，2003，4(7):671-677.

［8］Lehmann GM，McCabe MJ Jr.Arsenite slows S phase progression via inhibition of CDC25A dual specificity phosphatase gene transcription［J］.Toxicol Sci，2007，99(1):70-78.

［9］Lavecchia A，Di Giovanni C，Novellino E.CDC25A and B dualspecificity phosphatase inhibitors:potential agents for cancer therapy［J］.Curr Med Chem，2009，16(15):1831-1849.