張瑞峰 馬東明 姜希娟 盧 斌 蘇金玲 郭茂娟 (天津中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，天津 30093)

Sparks等〔1〕在研究高膽固醇血癥與阿爾茨海默病(AD)發(fā)病的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，以添加微量銅離子的蒸餾水代替自來水后，給予高膽固醇飲食的家兔，AD的形態(tài)和病理表現(xiàn)更突出。高脂血癥尤其是低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量的升高，已經(jīng)成為公認(rèn)的致動脈粥樣硬化(AS)的危險因素。我們在研究中發(fā)現(xiàn)銅與高脂飼養(yǎng)的家兔主動脈存在明顯的動脈粥樣硬化病變，銀杏葉提取物EGb761對這一病變具有一定的保護(hù)作用。銀杏葉提取物EGb761是按德國Schwabe專利工藝?yán)么既芤簭你y杏科植物銀杏葉中提取的有效成分，主要含有24%的銀杏黃酮苷和6%的萜烯內(nèi)酯，后者含5種銀杏內(nèi)酯(ginkolides A、B、C、M、J)和白果內(nèi)酯。近年來研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物具有一定的降脂作用。本研究將對銀杏葉提取物EGb761對銅和高膽固醇引起的動脈粥樣硬化的作用及其機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 銀杏葉提取物EGB761(商品名:金納多)，德國威瑪舒培博士藥廠，批號:9840808;膽固醇，分析純，天津市英博生化試劑有限公司，批號:090423;血清總膽固醇(TC)測定試劑盒，批號:090801;總甘油三酯(TG)測定試劑盒，批號:093071;高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定試劑盒，批號:090806;LDL-C測定試劑盒，批號:090080;均由中生北控生物科技股份有限公司提供。丙二醛(MDA)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供，批號:20090730;Trizol?Reagent(Invitrogen，Carlsbad，CA)試劑盒、Oligod(T)16，High capacity cDNA Re-verse Transcription Kit試 劑 盒 (Applied Biosystems、P/N:4368814)，Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(Applied Biosystems、P/N:4367659)、PCR引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。

1.2 主要儀器 722分光光度計，Image-Proplus圖像分析系統(tǒng)，HYBAIDPE480反轉(zhuǎn)錄儀，ABI7300實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)儀等。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物模型的建立與分組 健康成年雄性新西蘭大白兔(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供)27只，體質(zhì)量(2 356±212)g，在溫度(28±2)℃，濕度37% ～48%，12 h交替照明的清潔環(huán)境中給予普通飼料和自來水適應(yīng)喂養(yǎng)2 w后，隨機(jī)取出9只作為對照組，采用普通飼料和蒸餾水喂養(yǎng)，直至實驗結(jié)束，共9 w。其余家兔參照D.Larry Sparks等〔1〕的方法:給予2%高膽固醇飼料和含0.12×10－6銅離子(以硫酸銅的形式)的蒸餾水造模。6 w后，造模家兔死亡1只，將造模成功家兔隨機(jī)分為模型組(由于停用膽固醇后，家兔血清膽固醇水平會很快降低，因此，6 w后繼續(xù)給予高膽固醇飼養(yǎng)3 w，作為模型組，n=9)和 EGB761 組(EGB761 50 mg·kg－1·d－1灌胃 3 w，其余處理同模型組，n=8)。上述給藥劑量為“按照成人體表面積折算的等效劑量”。

1.3.2 標(biāo)本獲取與處理 實驗結(jié)束時禁食12 h，耳緣靜脈取血，分離血清，于－20℃下保存?zhèn)溆?。戊巴比妥鈉(25 mg/kg)靜脈麻醉后，迅速分離自心臟到髂動脈分叉處之間的主動脈，將動脈周圍的脂肪組織剔除干凈，縱向剖開，生理鹽水洗凈后蘇丹Ⅲ染色，數(shù)碼相機(jī)照相，采用Image-Proplus圖像分析系統(tǒng)測量斑塊面積占主動脈總面積的百分比。并于主動脈弓處取直徑3 mm的組織作HE染色。于肝臟相同位置取約100 mg組織塊，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和MDA水平測定 采用酶比色法測定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，硫代巴比妥酸(TBA)法測定血清MDA水平，具體操作依試劑盒說明進(jìn)行。

1.3.4 RT-PCR法測定肝LDLR和LRP1 mRNA表達(dá) 用Trizol試劑盒抽提肝組織總RNA，采用紫外分光光度計定量并檢測RNA純度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。特異性引物序列，GAPDH，F(xiàn):5'-TCTCTCAAgATTgTCAg-CAACg-3'，R:5'-CTTCACAAAgTggTCATTgAgg-3';LDLR，F(xiàn):5'-CAAgCCCAgggCCATCgTggTg-3'，R:5'-CACTgAAgATggCTTCgTT-gATg-3';LRP1，F(xiàn):5'-gCCAgAAgATCgACggCACC-3'，R:5'-TAgACgCTgCCACTgCggTA-3'。反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s→60℃延伸1 min，共40個循環(huán)。擴(kuò)增完畢后，運行融解曲線以驗證PCR過程中單一擴(kuò)增產(chǎn)物形成。所有目的基因(target)mRNA含量用比較域值的方法通過相對每個樣品的看家基因GAPDH 計算。目的基因量=2－ΔΔCT，ΔΔCT是目的基因和看家基因的循環(huán)域值的差值。數(shù)據(jù)通過對照組進(jìn)行標(biāo)化。ΔΔCT=(CTtarget-CTGAPDH)實驗組 －(CTtarget-CTGAPDH)對照組。

2 結(jié)果

2.1 主動脈病理形態(tài)病變 大體標(biāo)本肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，正常組家兔主動脈壁光滑未見粥樣硬化斑塊;模型組家兔可見其脂質(zhì)斑塊從升主動脈、主動脈弓處向下延伸，呈不規(guī)則片狀分布，突出于內(nèi)膜表面，蘇丹Ⅲ染色動脈粥樣硬化病變處顯示紅色;EGB761組主動脈壁斑塊形成的程度較低，僅在升主動脈或主動脈弓處可見少量散在分布的脂質(zhì)斑塊。與正常組相比，模型組和EGB761組斑塊面積顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與模型組相比，EGB761組斑塊面積明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。HE染色顯示，正常組血管內(nèi)膜光滑、連續(xù)、內(nèi)皮完整;模型組家兔主動脈內(nèi)膜明顯增厚，大量脂質(zhì)斑塊形成，脂質(zhì)斑塊肩部可見炎細(xì)胞浸潤，脂質(zhì)斑塊內(nèi)可見泡沫細(xì)胞聚集，細(xì)胞壞死，并有中膜平滑肌萎縮;EGB761組病變與模型組相似，但程度較輕。

2.2 血脂水平改變 與正常組相比，模型組和EGB761組血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均顯著升高，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組相比，EGB761組LDL-C水平顯著下降，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

2.3 肝組織LDLR和LRP1 mRNA表達(dá) 與正常組相比，模型組和EGB761組肝臟LDLR mRNA表達(dá)水平均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。EGB761組肝臟LRP1 mRNA表達(dá)，與模型組和正常組相比，均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

2.4 血清MDA水平改變 與正常組相比，模型組和EGB761組血清MDA水平均顯著升高，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組相比，EGB761組MDA水平顯著下降，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 EGB761對家兔主動脈斑塊面積和血清MDA水平的影響(±s)

表1 EGB761對家兔主動脈斑塊面積和血清MDA水平的影響(±s)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;下表同

組別 n MDA(nmol/ml) 斑塊面積/主動脈面積(%)正常組 9 2.82±1.171)0模型組 9 39.12±18.082) 54.72±18.11)EGB761組 8 17.98±18.551)2) 32.80±11.411)2)

表2 EGB761對家兔血脂的影響(±s，mg/dl)

表2 EGB761對家兔血脂的影響(±s，mg/dl)

TC TG LDL-C HDL-C組別(n)正常組(9) 50.28±10.822) 66.67±31.862) 0.27±0.132)1.09±0.222)模型組(9)1 390.34±314.721)848.72±226.361)14.37±2.381)5.38±0.431)EGB761組(8)1 512.22±254.161) 737.18±194.351) 8.05±1.411)2) 4.98±0.611)

表3 EGB761對家兔肝臟LDLR和LRP1 mRNA表達(dá)的影響(±s)

表3 EGB761對家兔肝臟LDLR和LRP1 mRNA表達(dá)的影響(±s)

0.38±0.25模型組 9 0.10±0.021) 0.20±0.10 EGB761組 8 0.10±0.041) 0.68±0.171)2)LDLR LRP1正常組 9 0.60±0.122)組別 n

3 討論

研究結(jié)果顯示，銀杏葉提取物EGB761能顯著減少主動脈粥樣硬化面積，具有延緩動脈粥樣硬化病變進(jìn)展的作用，與豐飛等的研究結(jié)果一致〔2〕。EGB761對動脈粥樣硬化的保護(hù)作用，可能與其降低血脂的作用有關(guān)。EGB761的降脂作用近年來已被越來越多的實驗研究證實。潘洪平等〔3〕發(fā)現(xiàn)銀杏葉片能顯著降低血瘀證模型大鼠的 TG和 LDL-C水平，對 TC、HDL-C無顯著作用。豐飛等〔2〕研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物對TC、TG、LDL-C、ox-LDL均有顯著的降低作用。張琪等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物能顯著降低已形成高脂血癥大鼠血漿中的TC、LDL-C，顯著升高HDL-C。雖然銀杏葉提取物對血清 TC、TG、HDL-C的作用研究結(jié)果不一致，但各項研究均顯示銀杏葉提取物具有降低升高的血清LDL-C的作用。本實驗研究結(jié)果也證實EGB761具有降低高脂血癥家兔血清LDL-C水平的作用。

LDL-C的清除主要在肝臟進(jìn)行，LDL-C與肝細(xì)胞膜上的LDLR結(jié)合，在LRP的協(xié)助下進(jìn)入肝細(xì)胞被降解清除。研究結(jié)果顯示EGB761能在轉(zhuǎn)錄水平上顯著升高LRP1。EGB761降低LDL-C的作用可能是通過促進(jìn)LRP的表達(dá)加速其清除作用實現(xiàn)的。MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，氧化損傷引起MDA生成量的增加，而MDA又可進(jìn)一步激發(fā)細(xì)胞多方面的損傷，MDA的量常常可反映機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化程度。研究結(jié)果顯示EGB761能顯著降低高脂血癥家兔血清MDA水平，與吳小明〔5〕的研究結(jié)果一致。苗軍等〔6〕的研究結(jié)果也顯示，銀杏提取物具有降低血清及肝組織過氧化脂質(zhì)的作用。

因此，銀杏葉提取物EGB761具有抑制動脈粥樣硬化形成的作用。其作用機(jī)制可能是通過降低LDL-C水平，抑制脂質(zhì)過氧化實現(xiàn)的。

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