張 科 楊寓玲 慈雅麗 王新燕 李淑英 (華北煤炭醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000)

人乳頭瘤病毒(HPV)屬小DNA病毒，與許多部位鱗狀上皮細(xì)胞良性及惡性腫瘤性病變有關(guān)，其中HPV感染與宮頸癌的相關(guān)性已得到公認(rèn)。近年來研究顯示，賁門癌的發(fā)生與HPV感染有關(guān)，但賁門癌發(fā)生與HPV的病原學(xué)意義尚未被公認(rèn)。為探討人乳頭瘤病毒與賁門癌發(fā)生的相關(guān)性，本研究應(yīng)用PCR法，并使用HPV L1基因區(qū)通用引物、HPV16型和18型別E6基因特異性引物對河北省保定市賁門癌組織進(jìn)行HPV檢測。

1 材料與方法

1.1 材料 河北省保定市賁門癌組織標(biāo)本50例(其中，新鮮手術(shù)切除組織標(biāo)本18例，組織切除后經(jīng)甲醛溶液浸泡標(biāo)本32例)，男性35例，女性15例，平均年齡為57(33～78)歲。新鮮手術(shù)切除組織標(biāo)本立即放入－70℃冰箱保存;經(jīng)甲醛溶液浸泡標(biāo)本用無菌PBS沖洗后放入－70℃冰箱保存。研究中陽性對照HPV16為宮頸癌標(biāo)本DNA;HPV18為Hela細(xì)胞DNA。

1.2 組織塊中全核酸的提取 使用北京百泰克生物計(jì)劃有限公司DNA提取實(shí)際盒，按說明書指示，賁門癌組織標(biāo)本經(jīng)液氮冷凍研磨后，提取組織全核酸后于－20℃保存。

1.3 HPV的PCR檢測 使用β-Actin作內(nèi)參(PCR產(chǎn)物為292 bp)，使用 HPV L1區(qū) GP5+/6+引物、HPV16E6和HPV18E6 型 特 異 性 引 物 進(jìn) 行 PCR 擴(kuò) 增。β-actin〔1〕、HPV GP5+/6+以及HPV16E6和HPV18E6型特異性引物的擴(kuò)增條件〔2〕。PCR 中使用了 Ex-Taq，每個(gè)反應(yīng)總體積為 25 μl，加入1 μl提取的組織全核酸作為模板。本研究使用的引物及擴(kuò)增產(chǎn)物的長度見表1。

表1 本研究中使用的擴(kuò)增引物

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本全核酸的提取和質(zhì)量控制 從圖1和圖2可以明顯看出代表人全核酸的條帶:新鮮手術(shù)切除組織標(biāo)本的全核酸在大約20 kb處有明顯的泳動條帶，而人類基因組核酸DNA泳動條帶約為20 kb，因此可判定所提DNA為人因組核酸DNA，并且DNA濃度比較均一;甲醛溶液浸泡標(biāo)本DNA提取后，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下進(jìn)行觀察，約在500～1 500 bp處有泳動條帶，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是標(biāo)本經(jīng)甲醛溶液浸泡后，使得標(biāo)本中的DNA發(fā)生了斷裂，因而出現(xiàn)較小斷裂片段。用β-actin作內(nèi)參檢測所提取DNA的質(zhì)量。圖1和圖2中，以293細(xì)胞提取全核酸為模板的陽性對照，其產(chǎn)物大小為292 bp，提取的賁門癌組織全核酸為模板的PCR產(chǎn)物大小與陽性對照相近，說明組織中所提全核酸可滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 標(biāo)本HPV檢測 對50例賁門癌樣品進(jìn)行了PCR檢測，用含有HPV16的宮頸癌標(biāo)本DNA及含有HPV18的Hela細(xì)胞DNA作為本組實(shí)驗(yàn)陽性對照，可觀察到約150 bp的GP5+/6+擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1和圖2)。與之參照，50例賁門癌樣品中，檢測到43例HPV陽性，HPV陽性率為86.0%;其中18例新鮮組織中，檢測到16例HPV陽性，HPV陽性率為88.9%;32例甲醛溶液浸泡組織中，檢測到27例 HPV陽性，HPV陽性率為84.4%，新鮮組織中HPV檢出率略高于甲醛溶液浸泡組織中HPV檢出率，其原因可能是甲醛溶液浸泡組織中DNA發(fā)生了斷裂所致。

從圖1和2可以看出，50例賁門癌樣品中，其中26例檢測到HPV16 E6基因，陽性率為52.0%，12例為HPV18 E6基因陽性，陽性率為24.0%，8例HPV16E6和18E6基因均陽性，為混合感染;50例樣品中，18例新鮮樣品中檢測到11例HPV16 E6基因，陽性率為61.1%，5例為HPV18 E6基因陽性，陽性率為27.8%，3例HPV16E6和18E6基因均陽性，為兩型混合感染，HPV16和HPV18總感染率為72.2%。32例甲醛溶液浸泡樣品中檢測到15例HPV16 E6基因，陽性率為47.9%，7例為HPV18 E6基因陽性，陽性率為21.9%，5例HPV16E6和18E6基因均陽性，為兩型混合感染，HPV16和HPV18總感染率為53.1%。將HPV檢測結(jié)果總結(jié)在表2。圖1和圖2可見，HPV，特別是HPV16和18兩型別在河北省保定市賁門癌樣品中占有較高的分布頻率。

圖1 18例賁門癌新鮮樣品中HPV檢測結(jié)果

圖中:1A，1～18是新鮮組織;2A，1～32是甲醛溶液浸泡組織中提取的DNA;1B(2B)中，293是293細(xì)胞系DNA為模板的陽性對照，1～18(1～32)為 β-actin內(nèi)參擴(kuò)增;1C和2C，293為293細(xì)胞系DNA為模板的陰性對照，HPV16和HPV18分別是以含有HPV16的宮頸癌標(biāo)本DNA及含有HPV18的Hela細(xì)胞DNA為模板的陽性對照，1～8(1～32)為GP5+/6+的擴(kuò)增;1D和2D中，293為293細(xì)胞系DNA為模板的陰性對照，HPV16是含有HPV16的宮頸癌標(biāo)本DNA為模板的陽性對照，HPV18是以含有HPV18的Hela細(xì)胞DNA為模板的HPV16型特異性對照，1～18(1～32)為HPV16E6的擴(kuò)增;293為293細(xì)胞系DNA為模板的陰性對照，HPV18是以含有HPV18的Hela細(xì)胞DNA為模板的陽性對照，HPV16是以含有HPV16的宮頸癌標(biāo)本DNA為模板的HPV18型特異性對照，1～18(1～32)為HPV18E6擴(kuò)增;圖1和圖2中M為寶生物M為λEcoT14 I，M1為100 bp DNA Ladder，Neg，為以無菌雙蒸水位模板的陰性對照。

圖2 32例賁門癌經(jīng)甲醛溶液浸泡樣品中HPV檢測結(jié)果

表2 河北省保定市賁門癌樣品中HPV DNA檢測結(jié)果

3 討論

賁門癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生和發(fā)展涉及多種因素。賁門癌發(fā)生與HPV感染有關(guān)。

HPV是一種常見的雙鏈DNA病毒，基因組約為8 000 bp，迄今為止已經(jīng)鑒定分離了100多種基因型。所有HPV均是嚴(yán)格的嗜上皮型病毒，分別感染鱗狀上皮與黏膜細(xì)胞。根據(jù)HPV致瘤能力的高低分為高危型，如常見的16型與18型;低危型，如常見的6型，11型等。高危型HPV感染常見于宮頸癌中，而低危型感染多與宮頸良性乳頭瘤病變及尖銳濕疣的發(fā)生相關(guān)〔3～5〕。

徐衛(wèi)國等〔6〕報(bào)道賁門癌中HPV檢出率為67.6%，食管癌中HPV檢出率為70%，二者的檢出率之間無顯著性差異。過去，在林州市食管癌切除組織樣品中，檢測出HPV16 E6基因和HPV18 E6基因，其陽性率分別為61.3%和25.8%;在廣東潮汕地區(qū)食管癌組織中HPV存在比率達(dá)到60%，同時(shí)，食管癌HPV16陽性細(xì)胞中，HPV DNA在宿主染色體上整合率較高;建立了30多年的食管癌EC109細(xì)胞株仍有HPV18型DNA存在;HPV E6E7基因?qū)肽苷T發(fā)食管上皮細(xì)胞永生化和癌變〔7〕。上述證據(jù)表明，HPV在食管癌發(fā)生中起一定的病因?qū)W作用，由此推測賁門癌的發(fā)生可能與HPV感染有關(guān)。

1 Lee DC，Cheung CY，Law AH，et al.p38 mitogen-activated protein kinase-dependent hyperinduction of tumor necrosis factor alpha expression in response to Avian influenza virus H5N1〔J〕.J Virol，2005;79:10147-54.

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6 徐衛(wèi)國，張力建，陸哲明，等.沈上消化道癌組織中人乳頭瘤病毒16及E6mRNA檢測的臨床意義〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2003;83(21):1910-4.

7 沈忠英，岑 山，蔡維佳，等.人乳頭狀瘤病毒18型E6E7基因誘導(dǎo)人胚食管上皮永生化〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，1999;13(2):121-3.