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沙棘果油對小鼠免疫調(diào)節(jié)的實驗研究

2011-08-04 03:26:04鄒元生李新蘭
水資源開發(fā)與管理 2011年4期
關(guān)鍵詞:果油軟膠囊沙棘

鄒元生,聶 勇,李新蘭

(1.高原圣果沙棘制品有限公司,北京 100037;2.河北神興沙棘研究院,石家莊 050000;3.湖北省疾病預(yù)防控制中心,武漢 430079)

國內(nèi)已有大量文獻(xiàn)報道,沙棘籽油具有增強免疫力、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗癌、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、抗炎生肌、抗?jié)?、保肝、抗衰老等廣泛保健藥理作用[1,2,3],而沙棘果油的活性作用報道較少。沙棘果油是從沙棘果肉和果汁中提出的油液。據(jù)國外報道,沙棘果肉比其種籽中的活性成分多近三分之二,故沙棘果油中含有的活性成分也較籽油中多。沙棘果油的穩(wěn)定性比籽油好,沙棘果油密封在常溫也可保存10年以上,而其種籽油只能保存1~2年[4,5]。本項目旨在研究沙棘果油對小鼠免疫調(diào)節(jié)作用,將其研制成增強免疫力軟膠囊保健食品,其結(jié)果報告如下:

1 研究材料

1.1 實驗動物

SPF級昆明種雌性小鼠,18~22g,由湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK (鄂)2003-0005;實驗動物使用許可證號:SYXK (鄂)2003-0014。動物飼養(yǎng)室溫度為24℃~26℃,濕度為60%~80%。

1.2 樣品來源及處理

軟膠囊內(nèi)容物為棕紅色油狀液體,來源于河北神興沙棘研究院,人體推薦日攝入量為3.0g/人/天。將膠囊內(nèi)容物用單甘脂配制成所需濃度的混懸液,供以下試驗用。

劑量分組:按人體推薦日攝入量0.05g/kg.BW擴大10、20、30倍設(shè)置低、中、高3個劑量組,即0.5、1.0、1.5g/kg.BW,共分4個實驗組,每實驗組包括空白對照組和溶劑對照組、低、中、高劑量組,各劑量組實驗動物數(shù)為10只。免疫實驗一組進(jìn)行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗;免疫實驗二組進(jìn)行淋巴器官/體重比值測定和碳粒廓清實驗。免疫實驗三組進(jìn)行ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗;免疫實驗四組進(jìn)行血清溶血素的測定和抗體生成細(xì)胞檢測。小鼠連續(xù)灌胃30d后開始試驗。各實驗組均按0.20ml/10g.BW容量經(jīng)口灌胃給予。

2 試驗方法和結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗

無菌取脾,置于盛有適量無菌Hank’s液平皿中,用鑷子輕輕將脾磨碎,制成單個細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾,用Hank’s液洗2次,每次離心10min(1000r/min)。然后將細(xì)胞懸浮于1mL的完全培養(yǎng)液中,用臺酚蘭染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù) (應(yīng)在95%以上),調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個/mL。將每一份脾細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中,每孔1ml,一孔加75μL COnA液(相當(dāng)于7.5μg/mL),另一孔作為對照,置5%CO2,37℃CO2孵箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h,每孔輕輕吸去上清液0.7mL,加入0.7mL不合小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,同時加入MTT (5mg/mL)50μg/孔,繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入1mL酸性異丙醇,吹打混勻,使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中,每個孔作3個平行孔,(100μg/孔)用酶標(biāo)儀以570nm波長測定光密度值。

2.1.2 二硝基氟苯 (DNFB)誘導(dǎo)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng) (DTH)

耳腫脹法。用1%DNFB(以1:1的丙酮麻油溶液配制)致敏小鼠后,第5d再用DNFB攻擊右耳,24h后處死動物剪下左右耳殼用打孔器取下直徑8mm的耳片,稱重,以左右耳的重量之差來表示DTH的程度。

2.1.3 血清溶血素的測定

血淋法。取羊血,用生理鹽水洗滌3次,每次離心 (2000r/min)10min。將壓積SRBC用生理鹽水配成2% (v/v)的細(xì)胞懸液,每只鼠腹腔注射0.2mL進(jìn)行免疫。4~5d后,摘除眼球取血于離心管內(nèi),放置約1h,將凝固血與管壁剝離,使血清充分析出,2000r/min離心10min,收集血清。

凝集反應(yīng):用生理鹽水將血清倍比稀釋,將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實驗板內(nèi),每孔100μL,再加入100μL 0.5% (v/v)的SRBC懸液,混勻,裝入濕潤的平盤內(nèi)加蓋,于37℃溫箱孵育3h,觀察血球凝集程度。根據(jù)血清凝聚程度的級別計算出抗體積數(shù)。

2.1.4 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗

半體內(nèi)法。制備20%的雞紅細(xì)胞懸液;每只鼠腹腔注射1mL該懸液,30min后處死動物,將其仰位固定于鼠板上,開腹,經(jīng)腹腔注入生理鹽水2mL,轉(zhuǎn)動鼠板1min,然后,吸出腹腔洗液1mL,平均分滴于2片載玻片上,37℃溫育30min;育畢用生理鹽水漂洗,晾干,以1∶1的丙酮甲醇溶液固定,4%Giemsa-磷酸緩沖液染色3min,再用蒸餾水漂洗晾干。油鏡下計數(shù)100個巨噬細(xì)胞,按下式計算吞噬率和吞噬指數(shù):

2.1.5 小鼠碳廓清試驗

按體重從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁(100mL/kg),待墨汁注入,立即計時。

注入墨汁后2、10min,分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μL,并立即將其加到2mL0.1%Na2CO3溶液中。各吸0.1mL于96孔酶標(biāo)板中,用酶標(biāo)儀在600nm波長處測光密度值 (OD),以Na2CO3溶液作空白對照。

將小鼠處死。取肝臟和脾臟,用濾紙吸干臟器表面血污,分別稱重。

以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力。按下式計算吞噬指數(shù)a。受試樣品組的吞噬指數(shù)顯著高于對照組,可判定該項實驗結(jié)果陽性。

2.1.6 抗體生成細(xì)胞檢測

取脫纖維的羊血,用生理鹽水洗滌3次,每次離心 (2000r/min)10min,每只鼠經(jīng)腹腔注射2% (v/v)SRBC 0.2mL。

將SRBC免疫4~5d后的小鼠頸椎脫臼處死,取出脾臟,放在盛有Hank’s液的小平皿內(nèi),輕輕磨碎脾臟,制成細(xì)胞懸液,經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾,離心 (1000/min)10min,用Hank’s液洗2遍,最后將細(xì)胞懸浮在5mL RPMI1640培養(yǎng)液中,計數(shù)細(xì)胞,并將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×106個/mL。

空斑的測定:將表層培養(yǎng)基 (1g瓊脂糖加雙蒸水至100mL)加熱溶解后,放45~50℃水浴保溫,與等量 pH7.2~7.4、2 倍濃度的Hank’s液混合,分裝小試管,每管0.5mL,再向管內(nèi)加50μL10%SRBC (v/v,用SA緩沖液配制),20μL 脾細(xì)胞懸液 (5x106個/mL),迅速混勻,傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上,做平行片,待瓊脂凝固后,將玻片水平扣放在片架上,放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1.5h,然后用SA緩沖液稀釋的補體 (1∶8)加入玻片架凹槽內(nèi),繼續(xù)溫育1.5h后,計數(shù)溶血空斑數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 試驗前后動物體重記錄

見表1、表2、表3、表4各組動物體重?zé)o明顯差異。

表1 實驗一組試驗前后動物體重記錄 (×±S)

表2 實驗二組試驗前后動物體重記錄 (×±S)

表3 實驗三組試驗前后動物體重記錄 (×±S)

表4 實驗四組試驗前后動物體重記錄 (×±S)

3.2.2 對動物淋巴器官/體重比值的影響

從表5可見,各組動物間胸腺/體重比值和脾臟/體重值無明顯差異。

表5 對動物淋巴器官/體重比值的影響 (×±S)

從表6可見,與溶劑對照組和空白對照組比較,高劑量組顯著性增強ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖能力 (P<0.05)。與溶劑對照組和空白對照組比較,軟膠囊高劑量組顯著性增強小鼠對DNFB誘發(fā)的DTH反應(yīng)(p<0.05)。

表6 軟膠囊對小鼠細(xì)胞免疫功能影響

從表7可見,與溶劑對照組和空白對照組比較,軟膠囊高劑量組可顯著性升高血清溶血素含量 (p<0.05)。

表7 軟膠囊對小鼠體液免疫功能的影響

從表8可見,與溶劑對照組和空白對照組比較,軟膠囊高劑量組明顯提高吞噬百分比、吞噬指數(shù) (p<0.05)。

表8 軟膠囊對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

從表9中可見,與溶劑對照組和空白對照組比較,軟膠囊高劑量組可顯著性提高小鼠碳廓清吞噬指數(shù) (p<0.05)。

表9 軟膠囊對小鼠碳廓清功能的影響

從表10可見,與溶劑對照組和空白對照組比較,軟膠囊高劑量組能明顯增強抗體生成細(xì)胞能力 (p<0.05)。

表10 軟膠囊對抗體生成細(xì)胞功能的影響

5 結(jié)論

(1)沙棘果油高劑量組能明顯增強ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力;

(2)沙棘果油高劑量組能明顯增強二硝基氟苯誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng);

(3)沙棘果油高劑量組能明顯升高小鼠血清溶血素含量;

(4)沙棘果油高劑量組能明顯增強小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞功能;

(5)沙棘果油高劑量組能明顯增強小鼠碳廓清能力;

(6)沙棘果油高劑量組能明顯增強抗體生成細(xì)胞能力;

(7)各劑量組與溶劑對照組比較,小鼠體重、淋巴器官/體重比值差異均無顯著性,沙棘果油在提高小鼠免疫力的同時沒有負(fù)面影響。

[1] 馬英才,張驍,王俊峰,編 .國際沙棘學(xué)術(shù)交流會論文集 [D].中國西安:1989:237-296.

[2] 徐銘漁,孫小宣,童文新,等 .沙棘的醫(yī)藥研究和開發(fā) [J].沙棘,1994,(1)

[3] 包文芳,孫一南 .沙棘屬植物藥理作用研究進(jìn)展[J].沈陽醫(yī)科大大學(xué)報,1997,(4)

[4] 張哲民,邱德明 .俄羅斯科學(xué)家研究沙棘抗癌進(jìn)展與探討 [J].沙棘,1997,10 (3):35.

[5] 車錫平,王世祥,康軍 .沙棘果油的毒性實驗研究 [J].沙棘,2001,(3).

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