沙棘果油對小鼠免疫調(diào)節(jié)的實驗研究

2011-08-04 03:26:04鄒元生李新蘭

水資源開發(fā)與管理 2011年4期

鄒元生，聶勇，李新蘭

（1.高原圣果沙棘制品有限公司，北京 100037；2.河北神興沙棘研究院，石家莊 050000；3.湖北省疾病預(yù)防控制中心，武漢 430079）

國內(nèi)已有大量文獻(xiàn)報道，沙棘籽油具有增強免疫力、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗癌、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、抗炎生肌、抗?jié)?、保肝、抗衰老等廣泛保健藥理作用［1，2，3］，而沙棘果油的活性作用報道較少。沙棘果油是從沙棘果肉和果汁中提出的油液。據(jù)國外報道，沙棘果肉比其種籽中的活性成分多近三分之二，故沙棘果油中含有的活性成分也較籽油中多。沙棘果油的穩(wěn)定性比籽油好，沙棘果油密封在常溫也可保存10年以上，而其種籽油只能保存1～2年［4，5］。本項目旨在研究沙棘果油對小鼠免疫調(diào)節(jié)作用，將其研制成增強免疫力軟膠囊保健食品，其結(jié)果報告如下：

1 研究材料

1.1 實驗動物

SPF級昆明種雌性小鼠，18～22g，由湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK （鄂）2003－0005；實驗動物使用許可證號：SYXK （鄂）2003－0014。動物飼養(yǎng)室溫度為24℃～26℃，濕度為60%～80%。

1.2 樣品來源及處理

軟膠囊內(nèi)容物為棕紅色油狀液體，來源于河北神興沙棘研究院，人體推薦日攝入量為3.0g/人/天。將膠囊內(nèi)容物用單甘脂配制成所需濃度的混懸液，供以下試驗用。

劑量分組：按人體推薦日攝入量0.05g/kg.BW擴大10、20、30倍設(shè)置低、中、高3個劑量組，即0.5、1.0、1.5g/kg.BW，共分4個實驗組，每實驗組包括空白對照組和溶劑對照組、低、中、高劑量組，各劑量組實驗動物數(shù)為10只。免疫實驗一組進(jìn)行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗；免疫實驗二組進(jìn)行淋巴器官/體重比值測定和碳粒廓清實驗。免疫實驗三組進(jìn)行ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗；免疫實驗四組進(jìn)行血清溶血素的測定和抗體生成細(xì)胞檢測。小鼠連續(xù)灌胃30d后開始試驗。各實驗組均按0.20ml/10g.BW容量經(jīng)口灌胃給予。

2 試驗方法和結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗

無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單個細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hank’s液洗2次，每次離心10min（1000r/min）。然后將細(xì)胞懸浮于1mL的完全培養(yǎng)液中，用臺酚蘭染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù) （應(yīng)在95%以上），調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個/mL。將每一份脾細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml，一孔加75μL COnA液（相當(dāng)于7.5μg/mL），另一孔作為對照，置5%CO2，37℃CO2孵箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔輕輕吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不合小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時加入MTT （5mg/mL）50μg/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個孔作3個平行孔，（100μg/孔）用酶標(biāo)儀以570nm波長測定光密度值。

2.1.2 二硝基氟苯（DNFB）誘導(dǎo)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng) （DTH）

耳腫脹法。用1%DNFB（以1：1的丙酮麻油溶液配制）致敏小鼠后，第5d再用DNFB攻擊右耳，24h后處死動物剪下左右耳殼用打孔器取下直徑8mm的耳片，稱重，以左右耳的重量之差來表示DTH的程度。

2.1.3 血清溶血素的測定

血淋法。取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心（2000r/min）10min。將壓積SRBC用生理鹽水配成2% （v/v）的細(xì)胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2mL進(jìn)行免疫。4～5d后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2000r/min離心10min，收集血清。

凝集反應(yīng)：用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實驗板內(nèi)，每孔100μL，再加入100μL 0.5% （v/v）的SRBC懸液，混勻，裝入濕潤的平盤內(nèi)加蓋，于37℃溫箱孵育3h，觀察血球凝集程度。根據(jù)血清凝聚程度的級別計算出抗體積數(shù)。

2.1.4 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗

半體內(nèi)法。制備20%的雞紅細(xì)胞懸液；每只鼠腹腔注射1mL該懸液，30min后處死動物，將其仰位固定于鼠板上，開腹，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2mL，轉(zhuǎn)動鼠板1min，然后，吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片載玻片上，37℃溫育30min；育畢用生理鹽水漂洗，晾干，以1∶1的丙酮甲醇溶液固定，4%Giemsa－磷酸緩沖液染色3min，再用蒸餾水漂洗晾干。油鏡下計數(shù)100個巨噬細(xì)胞，按下式計算吞噬率和吞噬指數(shù)：

2.1.5 小鼠碳廓清試驗

按體重從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁（100mL/kg），待墨汁注入，立即計時。

注入墨汁后2、10min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μL，并立即將其加到2mL0.1%Na2CO3溶液中。各吸0.1mL于96孔酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀在600nm波長處測光密度值（OD），以Na2CO3溶液作空白對照。

將小鼠處死。取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，分別稱重。

以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力。按下式計算吞噬指數(shù)a。受試樣品組的吞噬指數(shù)顯著高于對照組，可判定該項實驗結(jié)果陽性。

2.1.6 抗體生成細(xì)胞檢測

取脫纖維的羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心（2000r/min）10min，每只鼠經(jīng)腹腔注射2% （v/v）SRBC 0.2mL。

將SRBC免疫4～5d后的小鼠頸椎脫臼處死，取出脾臟，放在盛有Hank’s液的小平皿內(nèi)，輕輕磨碎脾臟，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，離心（1000/min）10min，用Hank’s液洗2遍，最后將細(xì)胞懸浮在5mL RPMI1640培養(yǎng)液中，計數(shù)細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×106個/mL。

空斑的測定：將表層培養(yǎng)基（1g瓊脂糖加雙蒸水至100mL）加熱溶解后，放45～50℃水浴保溫，與等量 pH7.2～7.4、2 倍濃度的Hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5mL，再向管內(nèi)加50μL10%SRBC （v/v，用SA緩沖液配制），20μL 脾細(xì)胞懸液（5x106個/mL），迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，做平行片，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1.5h，然后用SA緩沖液稀釋的補體（1∶8）加入玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)溫育1.5h后，計數(shù)溶血空斑數(shù)。