花圣卓,王宏昊,滕曉萍,溫中平

(高原圣果沙棘制品有限公司,北京 1000037)

很多年來,不僅僅是在亞洲國家,全球各地都在廣泛使用中藥[4,8]。適應(yīng)原是指可以增強耐力、心智力和人體非特異性抵抗力的中藥配方[4]。研究顯示:當(dāng)身體處于高壓力狀態(tài)時,補充某種營養(yǎng)品或中藥制劑可以增強抗應(yīng)激能力[2,14,19-22]。據(jù)推測,在高海拔、惡劣氣候環(huán)境下生長的植物,體內(nèi)有能維持它生命的生物分子。將動物置于高寒及缺氧環(huán)境下,給動物補充這些植物產(chǎn)品,就能夠增強它們的耐受力[6]。

沙棘 (胡頹子科),生長在海拔 2000～5000m的喜馬拉雅山脈西北側(cè),是一種從矮到高 (0.91～4.6m)、有分支,有固氮作用的原產(chǎn)于歐洲及亞洲的有刺落葉灌木[30]。這種植物的所有部分都含有很多生物活性物質(zhì)。沙棘的化學(xué)及植物化學(xué)成分隨著產(chǎn)地、生長環(huán)境及提取方法的不同而有所不同[1,36]。據(jù)報道,成熟的沙棘果實內(nèi)維生素 (A,C,E及K)、類胡蘿卜素、黃酮和有機酸的含量都非常高,而且沙棘果實、果漿、果油和籽油提取物具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化及抗菌作用[10,27],對治療胃潰瘍[32,34]、皮膚病[35]、冠心病[7]、輻射引起的氧化損傷[13]、傷口愈合[15]、血栓癥及血小板沉積[5]等各種疾病都有幫助。沙棘的醫(yī)學(xué)效用源自于豐富的抗氧化物質(zhì)[1,7]。

沙棘葉含有豐富的黃酮、丹寧酸及三萜烯[16],與沙棘果及種子的藥理作用相比,沙棘葉在藥理方面的研究不多。據(jù)報道,沙棘葉在70%乙醇中的提取物具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫[11]及抗炎[9]作用。在一個研究實驗中,在索氏提取器中用70%乙醇提取干燥的沙棘葉,口服單一劑量 (100mg/kg體重)提取物,發(fā)現(xiàn)具有抗應(yīng)激作用[12]。但是,沙棘葉調(diào)節(jié)壓力的劑量依賴性尚待研究。

本文研究了在低溫(5℃),低壓(428mmHg),抑制 (C-H-R)動物模型下[28],干燥沙棘葉水提物對小鼠的劑量依賴性適應(yīng)原活性。以及用干燥沙棘葉水提物對動物血漿及血液中生物化學(xué)和血液參數(shù)的安全性評價來研究提取物的急性或亞急性毒性作用。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

試驗用12～14周齡,重150±10g的雄性Sprague-Dawley大白鼠,在25±1℃及12h亮-暗循環(huán)的環(huán)境中生長,并用標(biāo)準(zhǔn)的食物及足量的水喂養(yǎng)。試驗的實施嚴(yán)格遵循動物道德委員會制定的制度及印度關(guān)于試驗動物照料及使用規(guī)范。

1.2 植物材料

在9月份兩個不同時間,采集于位于印度喜馬拉雅山脈西側(cè)高海拔地區(qū)的沙棘葉。生長在此的沙棘處于自然狀況下,可以排除由于區(qū)域及氣候條件不同造成的植物化學(xué)變化。將植物材料的憑證標(biāo)本保存于干燥標(biāo)本集內(nèi),在印度拉達克列野外實驗室內(nèi)實施植物的民族植物學(xué)鑒定。用水徹底清洗新鮮的沙棘葉,再用去離子水清洗。清洗過的新鮮沙棘葉在干凈的蔭涼處晾干,并用粉碎機碾碎。

1.3 提取準(zhǔn)備

用過濾的方法制備沙棘干葉的提取物。在室溫 (25±1℃)下,將沙棘干葉粉末浸泡于去離子水內(nèi) (1∶5w/v),24h后,將上清液倒出,殘留物重新浸泡于新鮮水中,這個過程重復(fù)4次直至完全提取。為了避免污染,在提取過程中要保證環(huán)境干凈無菌。將上清液收集在一起,通過軟細棉布過濾,置于有色琥珀瓶內(nèi),在 4℃、8000g下離心,然后在-20℃冷凍并用Heto冷凍干燥機 (HITOSICC,Heto-Holten A/S,丹麥)冷凍干燥。冷凍干燥后的沙棘葉水提物儲存于-20℃的密封玻璃瓶內(nèi)待用。冷凍干燥提取的原料產(chǎn)率采用重量分析法,稱量沙棘提取物的冷凍干燥粉末及沙棘干葉的質(zhì)量。由此可得出1g干燥沙棘葉可生產(chǎn)0.137g沙棘水提物冷凍干燥粉末。

1.4 提取物的表征

為了表征沙棘葉水提物,我們測量了它的HPLC指紋圖譜和酚總量。

1.4.1 HPLC指紋圖譜

用裝備有1000UV檢測器的AS-3000圖譜系統(tǒng) (Thermo Finnigan,美國)對沙棘葉水提物進行 HPLC分析。將20μ l的1mg/ml的提取物注入HPLC內(nèi),然后以1ml/min的速度注入色譜純甲醇水溶液 (40∶60v/v)。用粒徑為5μ m的反相 C-8柱 (250mm×4.7mm)對在310nm處具有紫外吸收的組分進行分離。

1.4.2 酚總量

用福林-喬卡梯奧試劑 (堿性磷酸酶定量試劑)檢測沙棘葉水提物中的酚總量。在1mg/ml的提取物儲備液中取20μ l,向其中加入 80μ l水和500μ l福林-喬卡梯奧試劑,室溫下靜置5min,然后加入400μ l 7.5%的碳酸氫鈉溶液,混合溶液后靜置30min產(chǎn)生顏色,并在765nm處具有紫外吸收。用0.1mg/ml的五倍子酸溶液制備標(biāo)準(zhǔn)吸光度-濃度曲線,沙棘葉水提物內(nèi)的酚總量就可以用此方法表示出來。

1.5 試驗設(shè)計

所有的試驗都是在過夜禁食的健康小鼠身上進行的,本研究進行了兩組試驗。第一組試驗,低溫 (5℃),低壓 (428mmHg),抑制 (C-HR)動物模型下,用小鼠評價干燥沙棘葉水提物最大有效適應(yīng)原活性劑量。另外一組試驗,用血漿生物化學(xué)參數(shù)、血液學(xué)參數(shù)和重要器官的器官/身體重量比來研究干燥沙棘葉水提物的急性及亞急性毒性。

1.6 劑量依賴性適應(yīng)原活性研究

沙棘葉水提物的劑量依賴性適應(yīng)原活性研究共用到66只小鼠,其中12只小鼠用來研究最大有效單劑量的多重劑量影響。沙棘葉冷凍干燥粉末溶于適量水中,得到相對小鼠體重的適量劑量,將小鼠置于C-H-R環(huán)境的30min前,用胃管灌入0.5ml提取物到隔夜禁食小鼠體內(nèi)。設(shè)置提取物體積與體重比分別為 3.125、6.25、12.5、25、50、100、150及 200mg/kg體重,每個劑量比對應(yīng)6只小鼠。用6只鼠作為對照組,將其置于C-H-R環(huán)境30min前,服用相同體積的水[28]。

將小鼠置于與海拔4572m相同的環(huán)境 (低溫 (5℃)、低壓 (428mmHg))內(nèi),限制鼠活動以便于用膠帶將直腸探針植入小鼠直腸內(nèi)2cm處。用 16道等溫記錄器 (Columbus Instrument,Columbus,OH)對小鼠直腸溫度每分鐘檢測一次,當(dāng)小鼠直腸溫度達到23℃時,將小鼠移出容器置于正常大氣壓和32±1℃的環(huán)境下使小鼠的體溫恢復(fù)到37℃?；謴?fù)期間,保持室溫恒定,在此期間,同樣限制小鼠的活動。檢測小鼠體溫到達 23℃及恢復(fù)到 37℃時的耐受性[28]。

5個劑量的沙棘葉水提物,每天服用一個劑量,研究它的最大有效適應(yīng)原劑量,然后用CH-R動物模型確定服用提取物多劑量是否具有累積的適應(yīng)原活性。用12只小鼠做多劑量研究,其余每組劑量用6只小鼠。

1.7 毒性研究

1.7.1 急性毒性試驗

用48只雄性隔夜禁食的小鼠研究急性毒性試驗,并分為4組,每組12只小鼠。每次給每組隔夜禁食的小鼠口服單劑量的1g/kg體重,2g/kg體重,5g/kg體重及10g/kg體重的冷凍干燥提取物,然后立即喂養(yǎng)食物和水,在接下來的24h或24d內(nèi)在密閉的籠子里觀察小鼠的死亡率及嚴(yán)重的毒性反應(yīng),如活動減退、毛發(fā)直立、厭食、分泌唾液、腹瀉、暈厥、肌肉抽筋及痙攣等。如果有小鼠死亡,在研究期間做好記錄并計算LD50值。

1.7.2 亞急性毒性試驗

用36只小鼠做亞急性毒性試驗,并分為3組,每組12只小鼠。第1組:每天按1g/kg體重的量給小鼠服用 0.5ml的提取物,共口服14d;第2組:每天按2g/kg體重的量給小鼠服用0.5ml的提取物,共口服14d;第3組作為對照組,每天給小鼠服用0.5ml的去離子水,共口服14d。試驗期間,小鼠自由進食,并且每天記錄小鼠的體重。14d試驗結(jié)束后從三組中取6只小鼠進行生物化學(xué)分析,另外6只用來進行血液學(xué)和器官與身體比重檢測。14d給藥結(jié)束后,小鼠隔夜禁食并用毛細管從眼窩處獲取臨床化學(xué)血液樣品,并將樣品收集于含有抗凝劑EDTA的管子內(nèi)。將小鼠處死后,將重要器官 (腎、肝臟、脾、腎上腺、睪丸、心臟和肺)解剖出來,并清除黏附在上面的結(jié)締組織和污漬,仔細稱重,確定器官與身體的比重。

另外24只小鼠做亞急性毒性試驗。12只小鼠每天口服最大有效劑量100mg/kg體重的沙棘提取物0.5ml,共口服30d。另外12只小鼠作為對照組每天口服0.5ml去離子水,共口服30d。每天記錄小鼠的體重。每組取出6只小鼠進行生物化學(xué)分析,另外每組取出6只小鼠進行血液學(xué)分析,每組12只小鼠都進行器官與身體的比重分析。30d給藥時間結(jié)束后,用毛細管從小鼠眼窩處獲取血液,并進行生物化學(xué)及血液學(xué)分析。將腎、肝臟、脾、腎上腺、睪丸、心臟和肺解剖出來,并清除黏附在上面的結(jié)締組織和污漬,仔細地稱重,確定器官與身體的比重。

1.8 生物化學(xué)分析

用Ascensia Entrust血糖試紙和血糖儀(Bayer Diagnostics India Ltd,Baroda,Gujarat,印度)測試空腹血糖指數(shù),并測定整體的乳酸脫氫酶。用Stat Prole Phox Plus血氣分析儀 (Nova Biomedical,Waltham,MA 02454-9141,美國)測定血清轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、膽紅素、肌氨酸酐、總膽固醇量、甘油三酯、血清蛋白及電解質(zhì)量。

1.9 血液學(xué)研究

用半自動微細胞計數(shù)器F-820(TOA Medical Electronics Corporation Ltd,Kobe,日本)對對照組及給藥組的小鼠進行血色素及其他血液學(xué)參數(shù)分析。

1.10 組織學(xué)

試驗結(jié)束后對所有小鼠進行驗尸,做組織學(xué)器官損傷評定。取出腎、肝臟、脾、腎上腺、睪丸、心臟和肺,用10%的中性福爾馬林緩沖溶液固定,然后經(jīng)過常規(guī)處理,包埋于石蠟中,用微切片機切取4μ m的薄片并安在玻璃片上,用蘇木精-伊紅染色,之后用光鏡觀察。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

用Graph Pad Prism 2.01對對照組和試驗組值進行 t檢驗,計算統(tǒng)計學(xué)差異。用 Graph Pad Prism 2.01對1g/kg體重及2g/kg體重劑量組做亞急性毒性試驗的小鼠的生物化學(xué)、血液學(xué)參數(shù)和器官與身體比重進行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 沙棘葉水提物的表征

提取物的 HPLC指紋圖譜圖如圖1所示,不同批次提取物的保留時間和峰面積的RSD都在2%以內(nèi)。

圖1 沙棘葉水提物在310nm處的指紋圖譜

總酚含量 沙棘葉水提物中的總酚含量 (沒食子酸當(dāng)量)為363mg/g(w/w)。

2.2 劑量依賴性適應(yīng)原活性研究

表1所示的是劑量依賴性適應(yīng)原活性研究的結(jié)果。沙棘葉水提物最低劑量 (3.125mg/kg)在加速壓力恢復(fù)中有顯著效用,小鼠從由C-HR導(dǎo)致的體溫 (23℃)恢復(fù)成正常體溫 (37℃)所需的時間縮短了 22.9%。濃度達到 6.25 mg/kg時,沙棘葉水提物對于抵抗C-H-R導(dǎo)致的體溫下降就幾乎沒有了作用。隨著使用的劑量的增加,對C-H-R導(dǎo)致的體溫下降的抵抗能力以及從低體溫中快速恢復(fù)的能力都有所提高。濃度達到100mg/kg時,對C-H-R導(dǎo)致的體溫下降的抵抗能力達到了最大值66.4%,同時使恢復(fù)能力提高了42%。然而,進一步增加藥物使用劑量并不能繼續(xù)提高對C-H-R導(dǎo)致的體溫下降的抵抗能力以及從低體溫中快速恢復(fù)的能力。所以,沙棘葉水提物的最大有效劑量為100mg/kg體重。

表2是連續(xù)5d每天單一劑量給藥處理的結(jié)果。經(jīng)過連續(xù)5d,每天單次口服100mg/kg劑量沙棘葉水提物,小鼠在C-H-R中體溫降低至23℃的時間以及從23℃恢復(fù)至37℃的時間與單次量用藥幾乎沒有區(qū)別。

表1 單劑量口服后,沙棘葉水提物的劑量依賴性適應(yīng)原活性

表2 多次單劑量口服后,沙棘葉水提物的劑量依賴性適應(yīng)原活性

2.3 毒性試驗

2.3.1 急性毒性試驗

表3給出了急性毒性試驗研究的結(jié)果。4組小鼠分別每次口服1,2,5和10g/kg沙棘葉水提物。死亡的小鼠中,50%在處理后24h之內(nèi)死亡或連續(xù)處理14d后死亡。

表3 使小鼠口服沙棘葉液體提取物導(dǎo)致的急性中毒情況 (LD50)

2.3.2 亞急性毒性試驗

在觀察期內(nèi),連續(xù)14d每日口服1,2g/kg體重的劑量后,所有小鼠仍然都很健康。處理組與對照組小鼠的體重均增長良好 (圖2)。表4中列出了小鼠連續(xù)14d每日口服1,2g/kg體重的劑量后的生化及血液指標(biāo)。觀察期間,實驗小鼠的生化指標(biāo)沒有變化 (每日口服1,2g/kg體重劑量,連續(xù)14日,與對照組對比)。然而,研究發(fā)現(xiàn)口服2g/kg劑量的小鼠與對照組相比血液指標(biāo)中紅血球數(shù)量顯著增長,導(dǎo)致紅細胞比容增加。表5中列出了口服1,2g/kg體重劑量藥物的小鼠的器官重量/體重比。與對照組相比,在1g/kg體重劑量下處理過的小鼠,除肝臟外其余器官 (心臟,腎臟,脾臟,腎上腺,睪丸,肺)的器官重量/體重比無明顯變化。而肝臟重量/體重的比有顯著增長。與對照組相比,在其余器官 (心臟,腎臟,脾臟,腎上腺,睪丸,肺)重量/體重比上無明顯變化的情況下,2 g/kg體重劑量藥物處理下的小鼠腎臟重量/體重比有所下降。

表4 小鼠連續(xù)14日每日口服1,2g/kg體重沙棘葉水提物的生化指標(biāo)及血液學(xué)參數(shù)

表5 小鼠連續(xù)14日每日口服1,2g/kg體重沙棘葉水提物的器官重量/體重比

表6 小鼠連續(xù)30日每日口服100mg/kg體重沙棘葉水提物的生化指標(biāo)及血液學(xué)參數(shù)

表7 小鼠連續(xù)30日每日口服100mg/kg體重沙棘葉水提物的器官重量/體重比

圖2 小鼠連續(xù)14d每日口服1,2g/kg體重沙棘葉水提物后的平均體重變化

圖3 小鼠連續(xù) 30d每日口服 100mg/kg體重沙棘葉水提物后的平均體重變化

在觀察期內(nèi),連續(xù)30d每日口服100mg/kg體重的劑量后,所有小鼠仍然很健康。處理組與對照組小鼠的體重均增長良好 (圖3)。表6中列出了小鼠連續(xù)30d每日口服100mg/kg體重的劑量后的生化及血液指標(biāo)。觀察期間,除了血清鈉降低外,相對于對照組,實驗鼠的生化指標(biāo)沒有變化。但是,在小鼠的血液學(xué)參數(shù)研究中,我們發(fā)現(xiàn),相對于對照組,實驗組的血細胞比容和血小板計數(shù)都顯著增加。表7中列出了連續(xù)30d每日口服100mg/kg體重劑量藥物的小鼠的器官重量/體重比。與對照組相比,在100mg/kg體重劑量下處理過的小鼠器官重量/體重比無變化。

在所有的檢測中,小鼠腎上腺,心臟,腎臟,肺,脾臟都具有完整的組織學(xué)形態(tài),只是在1,2g/kg體重劑量下,小鼠肝臟門脈周圍肝細胞表現(xiàn)出輕度空泡 (圖4)。

3 討論

圖4 對照組和實驗組小鼠口服沙棘葉水提物后肝臟組織的光學(xué)顯微圖 (H&E,×400)

在發(fā)展中國家,約有80%的人口在使用中草藥。盡管這些傳統(tǒng)藥物在廣泛使用,但對其安全性和有效性的研究卻不多。本文定量研究了沙棘葉水提物的 HPLC指紋圖譜以及總酚含量。該水提物酚類含量很高 (363mg/g沒食子酸當(dāng)量),可用于觀察適應(yīng)原活性。在劑量依賴性研究中,小鼠在C-H-R動物模型中沙棘葉水提物的最大適應(yīng)原活性劑量100mg/kg體重。目前只有一個研究沙棘葉抗應(yīng)激和適應(yīng)原活性的研究[12]。在這項研究中通過索氏提取用70%乙醇提取沙棘葉,將提取物用于動物模型,發(fā)現(xiàn)其最大口服量為100mg/kg體重。將小鼠在低溫缺氧環(huán)境下暴露半小時,該提取物能供給小鼠大約70%的耐寒能力,使小鼠在C-H-R動物模型中體溫降至23℃的時間延長 (112±11.4min vs對照組65min),并增加了33%的快速恢復(fù)能力(123±4.6min vs對照組 184±8.4min)[12]。將70%乙醇提取物[12]和本研究的水提物對比,發(fā)現(xiàn)它們在C-H-R動物模型中具有相同的御寒能力,但本研究中觀察到水提物的恢復(fù)能力更強(44%)。適應(yīng)原活性試驗采用5個劑量組,每日口服一次最大有效劑量 (100mg/kg體重),適應(yīng)原活性跟單劑量研究結(jié)果類似,這表明沙棘葉水提物不具有累積適應(yīng)原活性。

在亞急性期30d的實驗中采用100mg/kg體重的劑量,這個最大有效劑量是安全的,因為觀察期實驗動物體重增加率與對照組相似。實驗中實驗動物的生化參數(shù),屬于正常范圍,并沒有顯示出藥物損傷跡象。雖然有一個血清鈉水平顯著下降,卻也在正常范圍之內(nèi)。在血液參數(shù)研究中,血細胞比容的增加可能是由于平均紅細胞體積 (MCV)微量上升。在本研究中,實驗動物的血清乳酸脫氫酶 (LDH)和肌酐含量與對照組相似,表明亞急性毒性試驗中沙棘葉水提物并沒有對細胞膜的通透性、肌肉代謝、腎功能產(chǎn)生影響。在30d試驗中,對比實驗組和對照組器官重量/體重比,未發(fā)現(xiàn)采用最大劑量口服提取物對重要器官有毒副作用。

在最大劑量10～20倍 (1g和2g/kg體重)劑量組的亞急性毒性研究中,口服14d,跟對照組一樣,體重增加,跟毒性有關(guān)的生化參數(shù)即血清膽紅素,肌酐,谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (GPT)都沒有改變。眾所周知,肝臟代謝一系列的外源性和內(nèi)源性化合物,并且是生物解毒能力的一個良好的指標(biāo)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶的值未改變顯示出,持續(xù)14d口服1g和2g/kg體重沙棘葉水提物,沒有對小鼠肝臟產(chǎn)生毒性。但是1g/kg體重劑量組肝臟重量/體重比的增加和腎臟重量/體重比降低顯示出長時間高濃度的口服可能會影響肝臟和腎臟功能。1g/kg體重劑量組的動物顯示為腎組織正常,說明沒有對腎臟組織產(chǎn)生毒性。但是,在口服14d每天1g和2g/kg體重的劑量組中的動物肝臟病理標(biāo)本中,發(fā)現(xiàn)門脈周圍肝細胞有輕度空泡。但肝細胞無退行性改變,也沒有任何樣本中出現(xiàn)肝壞死或炎癥。肝功能的生化試驗即谷丙轉(zhuǎn)氨酶檢驗中,實驗組也沒有表現(xiàn)出異常。在組織學(xué)中觀察出輕度空泡不重要。結(jié)果表明,該植物提取物所用的劑量并沒有對試驗考察器官有顯著的毒性。

在本研究中,小鼠的血液參數(shù)在1g/kg體重劑量組中沒有改變。然而,在2g/kg體重劑量組中,小鼠的紅細胞數(shù)量大幅增加。看起來,低劑量的100mg/kg口服30d的時間和20倍劑量2g/kg藥量口服14d都可能對血液參數(shù)產(chǎn)生影響,如果一個10倍劑量 (1g/kg)口服持續(xù)超過14d時間,也可能會導(dǎo)致血液學(xué)參數(shù)變化。

物質(zhì)的急性毒性是指一次性接觸較大量的物質(zhì)對全身的損害能力。急性毒性研究的目的是為了確定半數(shù)致死量 (LD50),LD50值被用來表示50%的被暴露個體死于一種有害物質(zhì)的劑量。在本研究中沙棘葉水提物的LD50值大于10g/kg體重。在5、10g/kg體重劑量組中12只小鼠口服沙棘葉水提物24h后只有一只死亡(8.3%),這說明沙棘葉水提物的毒性非常低。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)小鼠處于C-H-R環(huán)境30min后,口服100mg/kg沙棘葉水提物具有明顯的適應(yīng)原活性。其 LD50值大于10g/kg。肝臟和腎臟的器官/體重比及在10和20倍最大有效劑量的高劑量組中組織學(xué)的變化,表明長期高劑量使用沙棘葉是需要謹(jǐn)慎。

[1] Beveridge,T.,Li,T.S.C.,Oomah,B.D.,Seabuckthorn products:manufacture and composition[J].J.Agric.Food Chem.1999,47,3480-3488.

[2] Bhargava,K.P.,Singh,N.Antistress activity of Ocimum sanctum Lin[J].Ind.J.Med.Res.1981,73,443-451.

[3] Bonsnes,R.W.,Taussky,H.H.On the colorimetric determination of creatinine by the Jaffe reaction[J].J.Biol.Chem.1945,158,581-591.

[4] Brekhman II.Man and Biologically Active Substances[M].Pergamon Press,Oxford,1980.

[5] Cheng,J.,Kondo,K.,Suzuki,Y.,et al.Inhibitory effects of total avones of Hippophae rhamnoides L.on thrombosis in mouse femoral artery and in vitro platelet aggregation[J].Life Sci.2003,72,2263-2271.

[6] Divekar,H.M.,Radhey,S.,Gupta,A.K.,Pahwa,et.al.Screening of Adaptogenic Activity of some Laddakhi Plants[J].1996,DIPAS(Min.of Defence,India)Report No.1/96.

[7] Eccleston,C.,Baoru,Y.,Tahvonen,R.,et al.Effect of an antioxidant rich juice(seabuckthorn)on risk factors for coronary heart disease in humans[J].J.Nutr.Biochem.2002,13,346-354.

[8] Fulder,S.,The drug that builds Russians[J].New Sci.1980,88,576-579.

[9] Ganju,L.,Padwad,Y.,Singh,R.,et al.Antiin ammatory activity of seabuckthorn(Hippophae rhamnoides)leaves[J].Int.Immunopharmacol.2005,5,1675-1684.

[10] Geetha,S.,Sai,R.M.,Singh,V.,Ilavazhagan,et.al.Anti-oxidant and immunomodulatory properties of seabuckthorn(Hippophae rhamnoides)-an in vitro study[J].J.Ethnopharmacol.2002,79,373-378.

[11] Geetha,S.,Sai,R.M.,Mongia,S.S.,Evaluation of antioxidant activity of leaf extract of Seabuckthorn(Hippophae rhamnoides L.)on chromium(VI)induced oxidative stress in albino rats[J].J.Ethnopharmacol.2003,87,247-251.

[12] Geetha,S.,Antioxidant,Immunomodulatory and Adaptogenic Potentialof Seabuckthorn(Hipphophae rhamnoides L.)-in vitro&in vivo Studies.Ph.D.Thesis Submitted to Delhi University,Delhi,2004,p.111.

[13] Goel,H.C.,Gupta,D.,Gupta,S.,et al.Protection of mitochondrial system of Hippophae rhamnoides L.against radiation induced oxidative damage in mice[J].J.Pharm.Pharmacol.2005,57,135-143.

[14] Grover,S.K.,Divekar,H.M.,Kumar,R.,et al.Experimental evaluation of a Composite Indian Herbal Preparation II(CIHP II)as an adaptogen and its mechanism of action[J].Int.J.Pharmacogn.1995,33,148-154.

[15] Gupta,V.,Gupta,A.,Saggu,S.,et al.Antistress and adaptogenic activity of L-arginine supplementation[M].eCAM 2(1),2005,93-97.

[16] Kallio,H.,Yang,B.,Peippo,P.Effects of different origins and harvesting time on vitamin C,tocopherols and tocotrienols in seabuckthorn(Hippophae rhamnoides L.)berries[J].J.Agric.Food Chem.2002,50,6136-6142.

[17] King,J.Practical Clinical Enzymology[M]..D.Van Nostrand,London,1965,441-443.

[18] Kornberg,A..Lactate dehydrogenase of muscle.Methods in Enzymology[M].Academic Press,New York,1969,11-16.

[19] Kumar,R.,Divekar,A.K.,Gupta,A.K.,et al.Enhanced thermogenesis in rats by Panax ginseng,multivitamins and minerals[J].Int.J.Biometeorol.1996,39,187-191.

[20] Kumar,R.,Grover,S.K.,Shyam,R.,et al.Enhanced thermogenesis in rats by a composite Indian herbal preparation-I and its mechanism of action[J].J.Altern.Complem.Med.1999,5,245-251.

[21] Kumar,R.,Shyam,R.,Divekar,H.M.,et al.Mechanism of increased tolerance to hypothermia after composite Indian herbal preparation II administration[J].J.Altern.Complem.Med.2000,6,509-517.

[22] Kumar,R.,Divekar,H.M.,Gupta,V.,et al.Antistress and adaptogenic activity of lecithin supplementation[J].J.Altern.Complem.Med.2002,8,487-492.

[23] Lowry,O.H.,Rosebrough,N.J.,Farr,A.L.,et al.Protein measurementwith the folin phenol reagent[J].J.Biol.Chem.1951,193,265-275.

[24] Lowry,O.H.,Roberts,N.R.,Mei-Ling,W.U.,et al.The quantitative histochemistry of brain:quantitative enzyme measurements[J].J.Biol.Chem.1954,207,19-37.

[25] M alloy,H.T.,Evelyn,K.A.,The determination of bilirubin with the photoelectric colorimeter[J].J.Biol.Chem.1937,119,481-490.

[26] M cM anus,J.F.A.,Mowry,R.W.,Staining M ethods:Histological and Histochemical[M].Harper and Row,New York.1965.

[27] Negi,P.S.,Chauhan,A.S.,Sadia,G.A.,Rohinishree,Y.S.,et al.Antioxidant and antibacterial activities of various seabuckthorn(Hippophae rhamnoides L.)seed extracts[J].Food Chem.2005,92,119-124.

[28] Ramachandran,U.,Divekar,H.M.,Grover,S.K.,et al.New experimental model for evaluation of adaptogenic products[J].J.Ethnopharmacol.1990,29,275-281.

[29] Riley,V.Adaptation of orbital bleeding technique to rapid serial blood studies[J].Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1960,104,751-754.

[30] Rousi,A.The genus Hippophae L.,a taxonomic study[J].Ann.Bot.1971,8,177-227.

[31] Singleton,V.L.,Rossi,J.A.Colorimetric of total phenolic with phosho-molybidic-phosphotungstic acid reagents[J].Am.J.Enol.Viticult.,1965,16,144-158.

[32] Suleyman,H.,Demirezer,L.O.,Buyukokuroglu,M.E.,etal.Antiulcerogeniceffect of Hippophae rhamnoidesL.Phytother[J].Res.2001,15,625-627.

[33] Wroblewski,F.,LaDue,J.S.,1956.Serum glutamic pyruvate transaminase in cardiac and hepatic disease[J].Proc.Soc.Exp.Biol.Med.91,569-571.

[34] Xing,J.,Yang,B.,Dong,Y.Effects of seabuckthorn(Hippophae rhamnoides L.)seed and pulp oils on experimental models of gastriculcer in rats.Fitoterapia 2002,73,644-650.

[35] Yang,B.,Kalimo,K.O.,Tahvonen,R.I.,et al.Effect of dietary supplementation with seabuckthorn(Hippophae rhamnoides)seed and pulp oils on the fatty acid composition of skin glycerophospholipids of patients with atopic dermatitis[J].J.Nutr.Biochem.2000,11,338-340.

[36] Zeb,A.Chemical and nutritional constituents of sea buckthorn juice[J].Pak.J.Nutr.2004,3,99-106.