呂曉萍,趙良友,于學武,鄭世民

(1.東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心,黑龍江 哈爾濱 150040;3.遼寧省動物疫病預防控制中心,遼寧 沈陽 110164)

益生素是指通過攝入適量從而對宿主產生有益作用的活菌[1]。益生素不僅可通過消化道發(fā)揮有益作用;還可外用于同樣存在固有菌群的泌尿系統(tǒng)和皮膚。益生素的主要功能包括:保持正常菌群,對抗感染、抑制癌癥和刺激免疫系統(tǒng)[2]。同時,除具有調節(jié)正常菌群達到促進健康作用外,還具有免疫調節(jié)作用,增強機體免疫功能[3]。隨著養(yǎng)殖業(yè)的大規(guī)模發(fā)展,飼養(yǎng)者為了治療動物疾病而濫用抗生素,導致動物體內致病菌產生耐藥性,無法控制某些疾病的發(fā)展和蔓延。為改變這一現(xiàn)狀,人們著力尋找能夠替代抗生素的天然添加劑,以減少動物性食品中藥物的殘留。目前研究和使用最多的是各種益生素。益生素作為免疫增加劑、抗生素的替代劑和動物性食品的增重劑廣泛應用于養(yǎng)殖業(yè)。本試驗旨在通過對雛雞局部免疫組織T淋巴細胞數量變化的研究,從細胞水平上檢測局部黏膜組織細胞免疫功能變化,揭示雛雞飼喂益生素、益生素與ND疫苗聯(lián)合應用局部黏膜組織細胞免疫的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 1日齡艾維因雛雞100只,雌雄各半,購自哈爾濱某孵化場。經雞傳染性囊病、雞馬立克病和雞傳染性支氣管炎等抗體檢測均為陰性。

1.2 產酶益生素 山東華爾康生物技術有限公司,生產批號為飼添字(2007)11178號,按產品說明使用。

1.3 新城疫疫苗 LaSota弱毒苗(Ⅳ系),哈藥集團生物疫苗有限公司,批號為200861,按產品說明使用。

1.4 試驗動物分組及處理 100只雛雞隨機分為益生素組(簡稱P組)、ND疫苗免疫組(簡稱V組)、益生素ND免疫組(簡稱P+V組)和對照組(簡稱N組)4組,每組25只雛雞,分別做如下處理:

P組雛雞分別于1日齡和18日齡連續(xù)灌服生理鹽水3 d,1次/d,并分別于10日齡和21日齡經點眼、滴鼻免疫新城疫弱毒苗,其中21日齡疫苗免疫劑量為10日齡的2倍。

P+V組雛雞除將V組的灌服生理鹽水改為灌服益生素外,其他處理與V組相同。

N組雛雞分別于1日齡和18日齡連續(xù)灌服生理鹽水3 d,1次/d,為正常對照。

1.5 試驗材料的采取及處理 N、P、V、P+V組雛雞分別于疫苗首次免疫后第0、7、14、28天和第42天,每組隨機抽取5只雛雞,心臟采血處死,快速采取哈德爾氏腺、盲腸扁桃體、十二指腸和回腸派伊爾結固定于4℃預冷的4%甲醛蔗糖緩沖液中,冰箱4℃固定24 h。

1.6 檢測指標及方法 (1)切片制備:固定組織經流水沖洗后,分別于 70%、80%、90%、100%Ⅰ和100%Ⅱ丙酮逐級脫水(時間依組織塊大小從30 min～60 min)、二甲苯透明、常規(guī)石蠟浸透、包埋和制片。(2)T細胞檢測:盲腸扁桃體、哈德爾氏腺、十二指腸和回腸派伊爾結 T細胞數量檢測應用ANAE染色法。(3)鏡檢計數:參考 Timo romppanen格點計數法[4],油鏡檢查免疫組織特定區(qū)域5個視野中的T細胞數量,以×103細胞/mm2表示。

1.7 數據處理 采用SPSS 13.0軟件進行數據處理,比較各組間差異。

2 結果

2.1 益生素雛雞ND疫苗接種后盲腸扁桃體T細胞數量變化

2.1.1 益生素雛雞ND疫苗接種后盲腸扁桃體彌散區(qū)T細胞數量變化 雛雞接種ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞盲腸扁桃體彌散區(qū) T細胞數量分別于第14天、第7～14天和第7～28天明顯高于ND疫苗單獨免疫雛雞、益生素雛雞和對照雛雞(P＜0.05或P＜0.01);益生素雛雞和ND疫苗單獨免疫雛雞上述被檢指標于免疫后7～28 d明顯高于對照雛雞(P＜0.05或P＜0.01);ND疫苗單獨免疫雛雞又于7～14 d高于益生素雛雞(P＜0.01);其余未見統(tǒng)計學差異(P＞0.05)(表1)。

表1 益生素ND免疫雛雞扁桃體彌散區(qū)T細胞數量變化 (×103個/mm2)

2.1.2 益生素雛雞ND疫苗接種后盲腸扁桃體淋巴小結T細胞數量變化 雛雞接種ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞盲腸扁桃體淋巴小結T細胞數量分別于第14天、第 7～14在和第7～28天明顯高于ND疫苗單獨免疫雛雞、益生素雛雞和對照雛雞(P＜0.05或P＜0.01);益生素雛雞和ND疫苗單獨免疫雛雞上述被檢指標于7～28 d顯著或極顯著高于對照雛雞(P＜0.05或P＜0.01);ND疫苗單獨免疫雛雞于免疫后7～17 d多于益生素雛雞(P＜0.01);其余未見統(tǒng)計學差異(P＞0.05)(表2)。

2.2 益生素雛雞ND疫苗接種后哈德爾氏腺T細胞數量變化

2.2.1 益生素雛雞ND疫苗接種后哈德爾氏腺分泌管周圍T細胞數量變化 雛雞接種ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞哈德爾氏腺分泌管周圍T細胞數量分別于第14天和第7～28天較益生素雛雞和對照雛雞顯著增多(P＜0.05或P＜0.01),益生素雛雞和ND疫苗單獨免疫雛雞分別于第14天和第7～28天明顯高于對照雛雞(P＜0.05或 P＜0.01),ND疫苗單獨免疫雛雞于免疫后第14天極顯著高于益生素雛雞(P＜0.01);其余未見統(tǒng)計學差異(P＞0.05)(表3)。

表2 益生素ND免疫雛雞盲腸扁桃體淋巴小結T細胞數量變化 (×103個/mm2)

表3 益生素ND免疫雛雞哈德爾氏腺分泌管周圍T細胞數量變化 (×103個/mm2)

2.2.2 益生素雛雞ND疫苗接種后哈德爾氏腺集合管周圍T細胞數量變化 雛雞接種ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞哈德爾氏腺集合管周圍T細胞數量于第14天極顯著高于益生素雛雞和對照雛雞(P＜0.01);ND疫苗單獨免疫雛雞分別于免疫后第14天和第14～28天明顯高于益生素雛雞和對照雛雞(P＜0.05或P＜0.01),其余未見統(tǒng)計學差異(P＞0.05)(表4)。

表4 益生素ND免疫雛雞哈德爾氏腺集合管T細胞數量變化 (×103個/mm2)

2.3 益生素雛雞ND疫苗接種后腸派伊爾結T細胞數量變化

2.3.1 益生素雛雞ND疫苗接種后十二指腸派伊爾結T細胞數量變化 雛雞接種ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞十二指腸派伊爾結T細胞數量分別于第14天和第14～28天明顯高于益生素雛雞和對照雛雞(P＜0.05或P＜0.01);ND疫苗單獨免疫雛雞分別于免疫后第14天和第7～14天顯著或極顯著高于益生素雛雞和對照雛雞(P＜0.05或P＜0.01),其余未見統(tǒng)計學差異(P＞0.05)(表5)。

表5 益生素ND免疫雛雞十二指腸派伊爾結T細胞數量變化 (×103個/mm2)

2.3.2 益生素雛雞ND疫苗接種后回腸派伊爾結T細胞數量變化 雛雞接種 ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞回腸派伊爾結 T細胞數量分別于第14天和第7～28天明顯高于益生素雛雞和對照雛雞(P＜0.05或P＜0.01);ND疫苗單獨免疫雛雞分別于免疫后第14天和第7～14天明顯高于益生素雛雞和對照雛雞(P＜0.01),其余未見統(tǒng)計學差異(P＞0.05)(表6)。

3 討論

益生素是良好的免疫增強劑,可提高機體細胞免疫和體液免疫,增強機體抵抗力[5]。在動物飼料中添加益生素,可促進機體免疫器官發(fā)育,提高T、B細胞數量,增強機體對抗原產生免疫反應,還可激活巨噬細胞、單核細胞等活性細胞分泌細胞因子,增強機體的抗病力[6]。研究發(fā)現(xiàn)[7],雙歧桿菌可促進免疫活性細胞表面IL-6、IL-10和IFN-α等細胞因子的表達;應用乳酸桿菌和芽孢桿菌后,動物腸道黏膜底層細胞增加,淋巴細胞、巨噬細胞,自然殺傷性細胞的吞噬功能增強,分泌多種細胞因子,如IL-4、IL-6和IL-10等可促進SIgA合成,使腸道免疫屏障作用增強,從而提高機體抵抗感染能力[8]。

表6 益生素ND免疫雛雞回腸派伊爾結T細胞數量變化 (×103個/mm2)

試驗結果發(fā)現(xiàn),雛雞接種ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞和ND疫苗單獨免疫雛雞的哈德爾氏腺、盲腸扁桃體和回腸派伊爾結 TANAE+細胞數量分別于免疫后第14天、第7～14天和第7～28天明顯高于未接種疫苗的益生素雛雞和對照雛雞(P＜0.05或P＜0.01)。表明ND疫苗接種提高了機體消化道局部黏膜的細胞免疫水平。產生上述變化的原因可能是:弱毒疫苗作為抗原進入機體后,首先被以巨噬細胞為主的抗原提呈細胞捕獲,一方面對其加工處理,濃集抗原決定簇于細胞表面;另一方面分泌細胞因子IL-1,在MHCⅡ類分子作用下,輔助性Th細胞(CD4+)識別并接受相應抗原決定簇和IL-1刺激,活化淋巴母細胞,使T細胞數量增加。致敏的Th細胞表達IL-2受體,同時釋放多種細胞因子,如 IFN-γ、IL-6、IL-10和 IL-13等,參與細胞免疫。未接種疫苗的雛雞,因沒有受到外源性抗原(弱毒疫苗)的刺激,機體局部免疫組織的T細胞并不致敏活化,不會大量增殖和分化,T細胞數量較接種了ND疫苗的雛雞沒有明顯的增加趨勢。

試驗結果還發(fā)現(xiàn),ND疫苗免疫42 d,益生素雛雞上述免疫組織的TANAE+細胞數量不同程度高于未服用益生素的對照雛雞,但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。表明益生素可促進免疫器官發(fā)育和激發(fā)雛雞局部黏膜組織的細胞免疫。產生上述變化的主要原因可能是:(1)益生素作為活菌制劑在雛雞腸道表面定植與繁殖,當其增殖至一定數量時,可刺激機體免疫組織發(fā)育和免疫應答。(2)益生素在腸道內繁殖,不斷合成免疫器官組織發(fā)育不可缺少的維生素和氨基酸等營養(yǎng)物質。(3)益生素自身組成成分,如脂多糖、肽聚糖和DNA等大分子釋放到機體腸道內,直接刺激機體免疫器官發(fā)育和激發(fā)機體免疫應答。(4)益生素作為免疫增強劑作用于機體,活化了腸黏膜內相關淋巴組織,使腸道黏膜底層細胞增加,呈現(xiàn)淋巴細胞、巨噬細胞和漿細胞浸潤,增強機體局部免疫功能。試驗結果發(fā)現(xiàn),益生素ND聯(lián)合應用雛雞的局部黏膜免疫組織TANAE+細胞數量均不同程度高于ND疫苗單獨免疫雛雞。其中益生素ND聯(lián)合應用雛雞盲腸扁桃體在免疫后第14天顯著高于ND單獨免疫雛雞(P＜0.05)。表明益生素與ND疫苗聯(lián)合使用,增強了雛雞局部黏膜的細胞免疫功能和對ND疫苗的免疫應答。產生這種變化的原因可能是:益生素中含有芽孢桿菌、雙歧桿菌和乳酸菌等,它們和弱毒疫苗抗原一樣,作為外源性物質,共同刺激機體的局部黏膜免疫系統(tǒng),使機體產生更強的免疫應答反應,也增強了機體對ND疫苗的免疫應答。

病原體侵染機體時,首先要突破機體與外界環(huán)境的屏障-黏膜表面。ND局部免疫部位也是NDV入侵門戶,因此,通過黏膜途徑激發(fā)的黏膜免疫在ND免疫中具有重要地位。益生素與ND疫苗聯(lián)合應用提高ND疫苗的局部細胞免疫水平,在ND防治中有嚴重意義。

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