崔德鳳,聶曉華,周 波,李煥榮,阮文科,張永紅,汪 明

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病流行病學(xué)與人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 海淀 100193;2.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 昌平 102206)

腸球菌屬(Enterococci)是乳酸菌中對營養(yǎng)要求不高、兼性厭氧、容易培養(yǎng)、分布廣泛的一類革蘭陽性球菌。腸球菌廣泛應(yīng)用于乳制品加工、蔬菜及肉制品的發(fā)酵工藝中。腸球菌在生長繁殖過程中除產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸外,還能產(chǎn)生多種具有抑菌或殺菌活性的細(xì)菌素,在抑制多種動(dòng)物源病原微生物和食物病原菌、腐敗菌等方面具有重要作用。

如何快速篩選和鑒定動(dòng)物源產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌,作為動(dòng)物飼料添加劑應(yīng)用或動(dòng)物傳染病的預(yù)防與治療顯得尤為重要。目前已報(bào)道的細(xì)菌素基因包括enterocin B,enterocin 1071 A,enterocin L50,enterocin A,mundticins等,本試驗(yàn)從健康豬胃腸道篩選出產(chǎn)廣譜Enterocin的腸球菌,并對細(xì)菌素的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究,擬采用分子生物學(xué)方法對分離的12株腸球菌進(jìn)行細(xì)菌素基因鑒定,為Enterocin的異源表達(dá)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基 糞腸球菌E1～E12,由本院微生物實(shí)驗(yàn)室分離保存;標(biāo)準(zhǔn)菌株糞腸球菌B1和屎腸球菌B2,購自中國科學(xué)院微生物研究所;MRS培養(yǎng)基,PYG培養(yǎng)基配方略。

1.2 主要試劑及儀器 胰蛋白酶、蛋白酶K Sigma公司;Taq DNA聚合酶,d NT Ps,10×PCR Buffer,核酸Marker DL-2部000,Gold view均購自北京匯天東方有限公司;Peasy-T 3克隆載體,DH5α感受態(tài)細(xì)胞,購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;DNA回收、純化及轉(zhuǎn)化試劑,購自 Tiangen公司;PXE 0.2型PCR儀,Thermo公司產(chǎn)品;MLS-3020型高壓滅菌鍋,Sanyo公司產(chǎn)品。

1.3 腸球菌染色體DNA的提取 分別將12株腸球菌接種到MRS培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)18h,連傳3代,采用CTAB法提取腸球菌染色體DNA,取1.5 mL培養(yǎng)物12000 r/min離心2 min;沉淀中加入576μL的TE緩沖液,反復(fù)吹打使之重新懸浮,加入30μL 10%SDS和15μL蛋白酶K混勻,于37℃溫育1 h;加入100μL 5 mol/L NaCl充分混勻,再加入80μL CTAB/NaCl溶液,混勻后在65℃溫育10 min;加入等體積的酚/氯仿/異戊醇25∶24∶1混勻,離心4～5 min,將上清轉(zhuǎn)入一只新管中,加入0.6～0.8倍體積的異丙醇,輕輕混勻直到DNA沉淀下來,沉淀可稍加離心;沉淀用1 mL的70%乙醇洗滌后,離心棄乙醇,自然風(fēng)干;加入30μL的 TE緩沖液溶解DNA。

1.4 PCR擴(kuò)增 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中報(bào)道的enterocin A 、enterocin B、enterocin as-48和enterocin T 8基因的序列,登錄號(hào)分別為:AF 099088,AF121254,x94181.1和AF005726。應(yīng)用軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增各個(gè)基因片段的特異性引物,見表1,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

在0.5 m L離心管中設(shè)置50μL PCR體系,以提取的腸球菌染色體DNA為模板,分別擴(kuò)增DNA片段entA,entB,as-48和T 8,PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性 5 min,進(jìn)入循環(huán):94℃變性30 s,55℃退火 30 s,72℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1。取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,以DNA Marker DL-2000為標(biāo)準(zhǔn)分子量,用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。

表1 檢測腸球菌素基因的PCR引物

1.5 PCR產(chǎn)物的回收與純化 在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳PCR產(chǎn)物,切下目的條帶,用DNA片段回收試劑盒回收。操作如下:按1∶3的比例加入溶膠液,使膠完全溶化,加入玻璃奶,顛倒混勻,12000 r/min離心30 s,吸棄上清,37℃烘干直至沉淀變?yōu)榘咨?加入適量的洗脫液,12000 r/min離心1 min,吸取上清備用。

1.6 細(xì)菌素基因的克隆與序列分析 將純化的PCR產(chǎn)物連接pGEM-T Easy載體,轉(zhuǎn)化DH5α載體菌,選取酶切鑒定后的陽性克隆,送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。利用DNAStar Gentyx等生物學(xué)軟件對檢測菌株序列與Gen Bank中參考序列進(jìn)行核苷酸、氨基酸同源性分析,確定腸球菌細(xì)菌素基因的類型。

2 結(jié)果與分析

2.1 12株腸球菌enterocinA基因的擴(kuò)增 應(yīng)用設(shè)計(jì)的4對特異性引物對12株分離的腸球菌和2株標(biāo)準(zhǔn)腸球菌染色體DNA進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增,采用梯度 PCR 擴(kuò)增法,從 E3、E4、E5、E9、E11 、B1 和B2染色體DNA中擴(kuò)增出entA基因,長度為274 bp,與預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小一致,見圖1,未從14株菌染色體DNA中擴(kuò)增出entB、as-48和T8基因。

圖1 E1～E12腸球菌enterocin A PCR擴(kuò)增

2.2 PCR產(chǎn)物的純化與克隆 使用北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的DNA片段回收試劑盒對entA進(jìn)行回收純化后,克隆到全式金Peasy-T 3載體上,然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。篩選具有氨芐青霉素抗性的白色菌落,提取質(zhì)粒DNA,進(jìn)行重組質(zhì)粒的PCR鑒定。圖略,鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序,序列分析顯示該片段含有enterocin A結(jié)構(gòu)基因,并分別命名為enterocin E3、enterocin E4 、enterocin E5、enterocin E9 和 enterocin E11。

2.3 腸球菌enterocin的氨基酸序列比較 圖2為20株腸球菌enterocin細(xì)菌素氨基酸序列的比較,包括14株Gen Bank上的參考株涉及Ⅰ～Ⅳ型enterocin和本試驗(yàn)擴(kuò)增出的6株enterocinA的氨基酸序列,可以看出 5株試驗(yàn)株與Ⅱa型參考株AB038464.1,AB292463.1,AM746970.1,GQ182975.1,GQ900435.1和X94181僅有1個(gè)氨基酸的差異,同源性達(dá) 99.76%～100%,與Ⅱb型 enterocin L50A,和enterocin L50 B以及Ⅱc型enterocin 1071A和Enterocin 1071B氨基酸差異較大,而與Ⅰ型羊毛硫抗生素Cycolysin Cyil,Ⅲ型環(huán)形熱敏感性大分子量蛋白enterocin AS-48和Ⅳ型復(fù)合型細(xì)菌素enterolysin A同源性較低,進(jìn)一步證明分離株腸球菌的細(xì)菌素屬于Ⅱa型enterocin A。

2.4 推導(dǎo)enterocin A的結(jié)構(gòu)預(yù)測 DNAStar結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示enterocin A的第22～30氨基酸形成α區(qū),N-端為親水區(qū),帶正電荷;C-端則為疏水區(qū),可以形成一個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。

3 討論

目前已經(jīng)分離鑒定了大量腸球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素,并命名為伏爾加霉素(enterocin),由于腸球菌屬細(xì)菌素的多樣性,在已有乳酸菌細(xì)菌素按化學(xué)組成和特性分類的基礎(chǔ)上,根據(jù)enterocin氨基酸序列、分子量提出了新的分類方法,將enterocin分為四型,Ⅰ型硫醚抗生素enterocin(lantibiotics分子量＜4 k Da)。Ⅱ型enterocin,分子量4～8 kDa,包含前導(dǎo)肽序列,Ⅱ型又分為3個(gè)亞型,Ⅱa屬于片球菌素家族e(cuò)nterocin,Ⅱb合成不需要前導(dǎo)肽的enterocin,Ⅱc為其他的線形非片球菌素類enterocin,Ⅲ型環(huán)形抗菌肽,Ⅳ型為大分子蛋白[1]。其中報(bào)道的enterocin絕大多數(shù)屬于Ⅱ型,已分離鑒定的enterocin包括Ⅰ～Ⅳ型,其中Ⅱ型種類、數(shù)量最多,屬于Ⅱa型的有enterocin A,mundticins,enterocin-CRL 35,bacteriocin31,bacteriocin T 8,bacteriocin,enterocin X和enterocin P,Ⅱb型包括enterocin L50,enterocin Q,enterocin MR108,Ⅱc型包括enterocin B,enterocin 1071 A和Enterocin 1071 B。enterocin產(chǎn)生菌涉及糞腸球菌、屎腸球菌、蒙氏腸球菌、嗜熱腸球菌、鉆黃腸球菌和耐久腸球菌等。分離菌大部分來源于食品,分離自動(dòng)物的腸球菌較少,只有分離自兔子糞便的屎腸球菌[2]、分離自馴化的野鴨[3]、來自牛胃腸道的蒙氏腸球菌以及來自野豬的屎腸球菌的報(bào)道[4]。屎腸球菌和糞屎腸球菌為enterocin主要產(chǎn)生菌,不同來源的同種腸球菌可以產(chǎn)生相同的細(xì)菌素,也發(fā)現(xiàn)了同一株腸球菌可以產(chǎn)生多種細(xì)菌素[5]。

本試驗(yàn)檢測并分析了12株分離自健康豬胃腸道腸球菌產(chǎn)生細(xì)菌素的基因及其遺傳特征,從其中5株菌 E3、E4、E5、E9、E11 擴(kuò)增出 entA 基因,與GenBank上enterocin A的同源性達(dá)99.76%～100%,根據(jù)細(xì)菌素氨基酸的結(jié)構(gòu)和組成及其生物學(xué)特性,表明5株腸球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素屬于Ⅱ型中的Ⅱa亞型。

圖2 分離株與Ⅰ～Ⅳ型enterocin的氨基酸序列比較

腸球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素包括enterocins A,P,CRL 35,1071 A和B,mundticin,mundticin KS,bacteriocin 31,RC714,T 8 and enterolysinA,enterocins A由于N端含有YGNGVXC序列并包含4個(gè)半胱氨酸殘基組成二硫鍵而屬于Ⅱa,這些特征與同屬此型的片球菌家族pediocin PA-1/AcH相同[5],enterocins A分離自腸球菌 ,來源有發(fā)酵香腸、烏欖、奶酪、米糠等,enterocinsA由 47個(gè)氨基酸組成,前導(dǎo)肽 18個(gè)氨基酸,組成細(xì)菌素前體,由ABC運(yùn)轉(zhuǎn)體在輔助蛋白的協(xié)助下轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外,enterocins A結(jié)構(gòu)基因編碼103個(gè)氨基酸的免疫蛋白,與編碼leucocin A免疫蛋白具有40%的同源性,enterocins A分子量大約4800 Da,enterocinsAS-48,B,EJ97,RJ11,MR10A&B,Q and L50A&B和bacteriocin 32由于結(jié)構(gòu)和遺傳特征不同于其他乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素而歸屬于Ⅱb、Ⅱc和Ⅲ型。細(xì)菌素氨基酸序列分析揭示,enterocin E5具有Ⅱa亞型的典型特征,N端片球菌素共有基序YGNGVXC和4個(gè)半胱氨酸殘基形成的2個(gè)二硫鍵穩(wěn)定結(jié)構(gòu)為enterocin A擁有活性的關(guān)鍵因素,carnobacteriocin B2共有基序置換后,對靶細(xì)胞的抗菌活性明顯降低[6],可見共有基序在細(xì)菌素產(chǎn)生菌的抑菌活性上起著重要的作用。

Ⅱa細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)基因編碼的細(xì)菌素前體,包括N-端延伸序列和C-端成熟肽部分。N-端延伸序列,為雙甘氨酸型(G-G-X)前導(dǎo)肽或者信號(hào)肽序列。延伸肽指導(dǎo)細(xì)菌素通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白機(jī)制或者sec-依賴機(jī)制進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。本試驗(yàn)擴(kuò)增的enterocin E5的entA結(jié)構(gòu)基因含有198個(gè)核苷酸,推導(dǎo)的基因產(chǎn)物為65個(gè)氨基酸的細(xì)菌素前體,N-端為由18個(gè)氨基酸組成的典型雙甘氨酸型前導(dǎo)肽。與其他Ⅱa細(xì)菌素的前導(dǎo)肽呈現(xiàn)較低的相似性。前導(dǎo)肽出現(xiàn)在大多數(shù)非硫醚細(xì)菌素和少數(shù)硫醚細(xì)菌素,來源不同菌株的enterocin A結(jié)構(gòu)基因具有99.72%同源性,推導(dǎo)的氨基酸序列完全相同。伴隨細(xì)菌素轉(zhuǎn)運(yùn)過程前體中的N-端前導(dǎo)肽序列在雙甘氨酸位點(diǎn)處被切除釋放成熟的細(xì)菌素分子,由47個(gè)氨基酸組成,含有4個(gè)半胱氨酸形成了2個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵,Ent A的N-端含有保守的YGNGV序列,具有親水性,C-端具有疏水性,形成跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)。推導(dǎo)的enterocin E5的分子量為4829 Da,氨基酸序列與enterocin A的完全一致。研究表明,Ⅱa型中的細(xì)菌素具有不同的三維結(jié)構(gòu),反映了對其靶細(xì)胞特異性的差異[7]。

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