魏 偉，苗永旺

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650201）

隨著人們生活水平的提高，奶制品以及加工工藝對(duì)原料奶質(zhì)量要求的提高，使得在使用抗生素治療奶牛乳腺炎時(shí)造成牛奶中抗生素殘留問(wèn)題越來(lái)越突出；另外，隨著奶牛向高產(chǎn)奶量方向選育，奶牛乳腺炎發(fā)病率也越來(lái)越高。因此，如何通過(guò)藥物預(yù)防和治療奶牛乳腺炎，如何減少牛奶中藥物殘留等方面，這些并不能從根本上解決奶牛乳腺炎發(fā)病率高的問(wèn)題。而對(duì)奶牛乳腺炎抗性候選基因的研究，選育出抗乳腺炎奶牛品種，這才是降低奶牛乳腺炎發(fā)病率的根本所在［1］。

乳腺炎（mastitis）是一種在奶牛業(yè)中多發(fā)的并且極其復(fù)雜的疾病，想通過(guò)一種單一方法去防治奶牛乳腺炎，效果并不理想。現(xiàn)在乳腺炎仍然是奶牛群中花費(fèi)最多的一種疾病，在美國(guó)將近要花費(fèi)20億美元用來(lái)預(yù)防乳腺炎和提高奶產(chǎn)品的質(zhì)量，日本將進(jìn)花費(fèi)690億日元［2］。Shook［3］報(bào)道，奶牛乳腺炎遺傳力僅為0.02～0.04?？梢?jiàn)其遺傳力較低，因此，對(duì)奶牛乳腺炎性狀進(jìn)行直接選擇的標(biāo)準(zhǔn)性很小。近年來(lái)，隨著是基因組學(xué)和生物信息學(xué)迅速發(fā)展，為乳腺炎抗病育種提供了新方法，尤其是現(xiàn)在基因芯片的廣泛使用及不同組織器官轉(zhuǎn)錄組深入研究，為奶牛乳腺炎抗病育種提供了新的前景。本文就奶牛乳腺炎抗性候選基因研究進(jìn)展作一綜述。

1 牛鋅指蛋白313（Znf313）基因

鋅指蛋白基因家族是一個(gè)巨大的超基因家族。鋅指蛋白是一類具有手指狀結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在基因的表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化等方面起重要的作用。

Znf313基因是鋅指蛋白家族的成員，參與基因表達(dá)調(diào)控。曹隨忠等［4］利用一個(gè)患乳腺炎奶牛外周血白細(xì)胞中差異表達(dá)的EST序列，采用了電子克隆和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合的方法，克隆了一個(gè)與奶牛乳腺炎抗性相關(guān)的基因cDNA編碼序列，并將該基因被命名為鋅指蛋白313基因，其開(kāi)放閱讀框架1～639bp，推測(cè)其編碼230個(gè)氨基酸。他們還將克隆的Znf313基因推測(cè)的編碼氨基酸序列與人和豬的Znf313基因編碼氨基酸序列進(jìn)行比較，相似性為95%和94%，揭示牛Znf313基因與人和豬Znf313基因具有相似的生物學(xué)功能。Ma等［5］克隆了人Znf313基因并研究了其生物學(xué)功能，結(jié)果表明人Znf313基因參與細(xì)胞分化。該基因在水牛上還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道，有待于進(jìn)一步研究。

2 前腦鋅指蛋白基因

前腦鋅指蛋白（forebrain embryonic zinc finger－like，F(xiàn)EZL）是鋅指蛋白基因家族中的成員，作為轉(zhuǎn)錄因子在動(dòng)物的神經(jīng)發(fā)育中起重要的作用，主要調(diào)控單胺能（monoaminergic）的神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育和機(jī)體的先天性免疫。

Sugimoto等［2］研究證明奶牛乳腺炎能夠誘發(fā)乳腺中FEZL的表達(dá)，而FEZL能促進(jìn)SEMA5A的表達(dá)。SEMA5A表達(dá)量的提高能夠誘發(fā)與宿主免疫反應(yīng)相關(guān)的至少九個(gè)基因的表達(dá)，包括TNF－α和IL－8。通過(guò)測(cè)序?qū)Ρ龋赘腥橄傺仔蛡€(gè)體的FEZL序列與抗乳腺炎型個(gè)體的FEZL基因序列差異只是存在一個(gè)三個(gè)堿基的插入突變，導(dǎo)致FEZL氨基乙酸鏈長(zhǎng)由12變成13。因?yàn)镕EZL氨基乙酸鏈的長(zhǎng)度影響它的轉(zhuǎn)錄活性，從而控制細(xì)胞因子的表達(dá)。隨后Sugimoto等［6］研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)育種值估計(jì)來(lái)評(píng)價(jià)體細(xì)胞評(píng)分（somatic cell score，SCS），攜帶雜合12G的公畜的SCS明顯要低于攜帶純合的13G公畜，因此選擇攜帶雜合12G的公畜可以減少乳腺炎的發(fā)病率。該基因在黃牛上有研究，水牛上還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

3 TLR4基因

TLR4（toll－like receptor 4）是 TLRs（toll－like receptors）家族的重要成員之一，屬于I型跨膜蛋白，該蛋白胞外區(qū)高度變異，以適應(yīng)不同配體分子的需要，胞內(nèi)區(qū)卻很保守，以便維持信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的需要［7］。牛 TLR4基因位于牛的8號(hào)染色體上［8］，全長(zhǎng)11Kb，在機(jī)體炎癥反應(yīng)啟動(dòng)和病原微生物的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。

王興平等［9］采用 CRS－PCR（create restricti on site combined with restriction fragment length polymorphism）方法擴(kuò)增了奶牛TLR4基因第三外顯子243bp的目的片段，通過(guò)限制性內(nèi)切酶Hinf I酶切篩查多態(tài)位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物27bp處C－T突變?cè)斐删幋a氨基酸由蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼?，結(jié)果表明AA基因型為乳腺炎抗性基因型，A等位基因?yàn)槿橄傺卓剐杂欣?。劉文嬌等?0］采用PCR－RFLP（polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism）方法對(duì)奶牛TLR4基因第三外顯子321bp的部分序列進(jìn)行多態(tài)性分析，通過(guò)限制性內(nèi)切酶Bbv12I酶切篩查多態(tài)位點(diǎn)，C－T突變導(dǎo)致編碼氨基酸由蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼?，結(jié)果表明不同基因型奶牛的SCS表現(xiàn)出CC基因型＞CT基因型＞TT基因型的趨勢(shì)。該基因在水牛上有相關(guān)的研究，但只有該基因的核苷酸序列。

4 TLR2基因

TLR2（toll－like receptor 2）是 TLRs家族中的第2個(gè)成員，能夠識(shí)別多種病原微生物及其產(chǎn)物，介導(dǎo)天然免疫，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動(dòng)獲得性免疫。牛TLR2基因被定位在17號(hào)染色體上［8］。

Petzl等［11］對(duì)14頭未感染乳腺炎的奶牛乳腺接種大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR（Real－time Quantity PCR）檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌侵染后可顯著增加TLR2、TLR4以及β－防御素（β－defensin）的表達(dá)，而接種金黃色葡萄球菌后可顯著增加β－防御素的表達(dá)。白杰等［12］對(duì)TLR2基因編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序，在第二外顯子發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNPs，然后對(duì)這3個(gè)SNPs進(jìn)行PCR－RFLP檢測(cè)，結(jié)果揭示189、631位點(diǎn)的SNP對(duì)奶牛的SCS有較大影響，而2260位點(diǎn)的SNP可能會(huì)提高奶牛的SCS。

5 乳鐵蛋白基因

乳鐵蛋白（lactoferrin，Lf）是保護(hù)乳腺組織的防御因子之一，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族［13］，具有廣譜的抗菌作用。編碼乳鐵蛋白的基因被定位在22號(hào)染色體上，而且乳鐵蛋白濃度能被遺傳（h2＝0.4）［14］，其含量和乳腺炎的發(fā)生存在相關(guān)性，并發(fā)現(xiàn)在復(fù)原的乳腺組織內(nèi)Lf能極大地阻止葡萄球菌和大腸桿菌生長(zhǎng)。

Diarra［15］認(rèn) 為，N－乙 酰－β－D－氨 基 葡 萄 糖 苷 酶（N－acetyl－β－D－glucosaminidase，NAGase）不僅僅可以作為乳腺炎檢測(cè)的一個(gè)指標(biāo)，而且該酶還具有一定的免疫活性，通過(guò)與Lf協(xié)同作用，能夠抑制某些病原微生物的活性。因此，從生理作用、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)到表達(dá)等各個(gè)水平深人研究NAGase在乳腺炎發(fā)生中的作用，對(duì)研究奶牛乳腺炎的檢測(cè)、治療乃至乳腺炎抗性的遺傳選育等都具有重大意義。王洪梅等［16］采用 PCR－RFLP、CRS－PCR 方法研究了中國(guó)荷斯坦牛Lf基因的啟動(dòng)子區(qū)，結(jié)果表明Lf基因啟動(dòng)子區(qū)72位的AB基因型和478位的CC基因型均是奶牛乳腺炎抗性的優(yōu)良基因型，可作為分子標(biāo)記應(yīng)用于奶牛乳腺炎抗性篩選。

6 趨化因子受體基因

趨化因子（chemokine）是指一類能夠趨化細(xì)胞定向移動(dòng)的小分子分泌蛋白。趨化因子受體屬于G蛋白偶聯(lián)7次跨膜受體家族［17］，大小一般由350～360個(gè)氨基酸組成。趨化因子通過(guò)與受體的結(jié)合，對(duì)免疫細(xì)胞在體內(nèi)的遷移、活化和分布起重要作用，并參與免疫應(yīng)答的調(diào)控，與機(jī)體抵抗感染（如HIV感染）等密切相關(guān)。

牛CXCR1基因被定位在2號(hào)染色體距著絲粒約90.3cM 處，其 mRNA 全長(zhǎng)是1083bp［18］。陳仁金等［18］采用PCR－SSCP方法研究了CXCR1基因的5＇側(cè)翼區(qū)和編碼區(qū)進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)1830（A/G）位點(diǎn)AA基因型、1768（T/A）位點(diǎn)TT基因型和344（T/C）位點(diǎn)TT基因型以及根據(jù)發(fā)現(xiàn)的4個(gè)SNPs預(yù)測(cè)的10種單倍型中單倍型Haplo2（ATTA）純合體對(duì)中國(guó)荷斯坦牛的SCS具有較大的遺傳效應(yīng)，可作為分子標(biāo)記應(yīng)用于奶牛乳腺炎抗性的篩選。

當(dāng)牛乳房發(fā)炎時(shí)，嗜中性粒細(xì)胞將從血液中遷移到病菌感染處，通過(guò)與其受體結(jié)合吞噬病原體。研究表明，CXCR2基因多態(tài)性與牛的臨床和亞臨床性乳腺炎對(duì)疾病敏感性相關(guān)［19］。Younggerman等［20］研究了CXCR2基因的777位的SNP與乳腺炎抗性之間的關(guān)系，777位SNP基因型和隱性乳腺炎的表達(dá)顯著相關(guān)。劉文嬌等［21］采用測(cè)序技術(shù)對(duì)CXCR2基因編碼區(qū)進(jìn)行了多態(tài)性篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在612位、684位、777位、855位、858位和861位有6個(gè)SNPs，其中612位和777位SNPs可作為奶牛乳腺炎抗性分子標(biāo)記位點(diǎn)。該基因在水牛上沒(méi)有相關(guān)研究報(bào)道。

7 熱休克蛋白70

熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）作為蛋白成熟過(guò)程中的分子伴侶通過(guò)分子伴侶作用參與新生蛋白質(zhì)折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、損傷蛋白質(zhì)的修復(fù)和抗原呈遞等許多重要體內(nèi)過(guò)程，其表達(dá)能夠減少NO的合成釋放，減輕炎癥因子對(duì)細(xì)胞的損傷。牛的HSP70由HSP70－1和 HSP70－2這兩個(gè)基因編碼，都被定位在染色體23q13。程維杰等［22］采用PCRSSCP和PCR－RFLP方法研究了中國(guó)荷斯坦奶牛HSP70－1基因編碼區(qū)的多態(tài)性及其與中國(guó)荷斯坦牛SCS的相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)1623位點(diǎn)和2409位點(diǎn)2個(gè)SNPs，1623位點(diǎn)基因型與SCS相關(guān)性顯著（P＜0.05），2409位點(diǎn)基因型與SCS相關(guān)性不顯著（P＞0.05），CC基因型可作為改良奶牛乳腺炎抗性性狀的分子遺傳標(biāo)記。該基因在水牛上也沒(méi)有相關(guān)研究報(bào)道。

［1］Heringstad B，Klemetsdal G，Ruane J.Selection for mastitis resistance in dairy cattle：a review with focus on the situation in the Nordic countries［J］.Livestock Production Science，2000，64（2－3）：95－106.

［2］Sugimoto M，F(xiàn)ujikawa A，Womack J E，et al.Evidence that bovine forebrain embryonic zinc finger－like gene influences immune response associated with mastitis resistance［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103（17）：6454－6459.

［3］Shook G E，Schutz M M.Selection on somatic cell score to improve resistance to mastitis in the United States［J］.Journal of Dairy Science，1994，77（2）：648－658.

［4］曹隨忠，李宏濱，姚學(xué)萍，等.奶牛乳房炎抗性相關(guān)基因Znf313的電子克隆與序列分析［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23（1）：6－8.

［5］YONG－XIN M A，SI－ZHONG Z，YI－PING H，et al.Identification of a novel human zinc finger protein gene ZNF313［J］.Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2002，35（3）：230－237.

［6］Sugimoto M，Itoh T，Gotoh Y，et al.Short communication：Enhanced clinical mastitis resistance in Holsteins with a FEZL p.Gly105 （12＿13）polymorphism［J］.Journal of Dairy Science，2011，94（4）：2103－2107.

［7］賈紅敏，盧立志，石放雄，等.動(dòng)物TLR4基因多態(tài)性及其抗病相關(guān)性研究進(jìn)展［J］.生命科學(xué)，2010，22（6）：546－550.

［8］Mcguire K，Jones M，Werling D，et al.Radiation hybrid mapping of all 10characterized bovine Toll‐like receptors［J］.Animal genetics，2006，37（1）：47－50.

［9］王興平，許尚忠，馬騰壑，等.牛TLR4基因的遺傳多態(tài)性與乳房炎的關(guān)聯(lián)分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，38（2）：120－124.

［10］劉文嬌，孫少華，李雪梅.TLR4基因外顯子ⅢBbvl2I酶切位點(diǎn)多態(tài)性與奶牛乳房炎的相關(guān)分析［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2008，10（2）：114－118.

［11］Petzl W，Zerbe H，Gunther J，et al.Escherichia coli，but not Staphylococcus aureus triggers an early increased expression of factors contributing to the innate immune defense in the udder of the cow［J］.Veterinary research，2008，39（2）：18－40.

［12］白 杰，林嘉鵬，袁 芳，等.TLR2基因多態(tài)性與奶牛體細(xì)胞評(píng)分的相關(guān)性研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42（3）：356－362.

［13］Pfaffl M W，Wittmann S L，Meyer H，et al.Gene expression of immunologically important factors in blood cells，milk cells，and mammary tissue of cows［J］.Journal of Dairy Science，2003，86（2）：538－545.

［14］Pfaffl M W，Wittmann S L，Meyer H，et al.Gene expression of immunologically important factors in blood cells，milk cells，and mammary tissue of cows［J］.Journal of Dairy Science，2003，86（2）：538－545.

［15］Diarra M S，Lacasse P，Grondin G.Impact of lactoferrin or lactoferricin with or without penicillin G on the mor phology and ultrastructure of Staphylococcus aureus［J］.J Dairy Sci，2002，85（5）：1141－1149.

［16］王洪梅，孔振興，王長(zhǎng)法，等.奶牛乳鐵蛋白基因5′側(cè)翼區(qū)遺傳多態(tài)性及其與乳腺炎關(guān)聯(lián)性分析［J］.遺傳，2009，31（4）：393－399.

［17］Murdoch C，F(xiàn)inn A.Chemokine receptors and their role in inflammation and infectious diseases［J］.Blood，2000，95（10）：3032－3043.

［18］陳仁金，楊章平，毛永江，等.中國(guó)荷斯坦牛CXCR1基因遺傳多態(tài)性與體細(xì)胞評(píng)分的關(guān)聯(lián)分析［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（18）：3848－3856.

［19］Chrystal M A，Seykora A J，Hansenl B，et al.Heritability of teat－end shape and the relationship of teat－end shape with somatic cell score for an experimental herd of cows［J］.Journal of Dairy Science，2001，84（11）：2549－2554.

［20］Youngerman S M，Saxton A M，Oliver S P，et al.Association of CXCR2polymorphisms with subclinical and clinical mastitis in dairy cattle［J］.Journal of Dairy Science，2004，87（8）：2442－2448.

［21］劉文嬌，孫少華，李雪梅，等.CXCR2基因多態(tài)性與奶牛體細(xì)胞評(píng)分的關(guān)聯(lián)性［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，30（1）：123－127.

［22］程維杰，李秋玲，王長(zhǎng)法，等.荷斯坦牛HSP70－1基因遺傳多態(tài)性與乳腺炎抗性關(guān)系［J］.遺傳，2009，31（2）：169－174.