郭曉瑞 吳志遠(yuǎn) 黃海華 羅少軍 梁杰

2002年，MicroRNAs(miRNAs)的發(fā)現(xiàn)被《Science》雜志評(píng)為十大科技突破第一名，近年來(lái)，已然成為生命科學(xué)研究的重要熱點(diǎn)之一。在動(dòng)、植物及病毒等生物中發(fā)現(xiàn)了一系列小分子非編碼 RNA(small noncoding RNA)，包括 miRNA，siRNA，piRNA，esiRNA等，它們組成了RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡等一系列生理進(jìn)程，并與多種人類(lèi)疾病密切相關(guān)［1］。

1 MicroRNA的生物合成及其作用機(jī)制

microRNA在基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，是一類(lèi)長(zhǎng)度為21～24 nt的非編碼小RNA，參與多種生物學(xué)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)［2］。成熟的microRNA分子的形成過(guò)程包含若干步驟:microRNA基因通過(guò)RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄合成原始microRNA(pri-microRNA)，pri-microRNA 具有 5'端的帽子、3'端的polyA尾的結(jié)構(gòu)特征;pri-microRNA經(jīng)過(guò)兩次酶的剪切產(chǎn)生成熟的microRNA。動(dòng)物pri-microRNA第一次剪切在細(xì)胞核內(nèi)，經(jīng)Dorsha酶切產(chǎn)生大小約為70個(gè)核苷酸并形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的microRNA(pre-microRNA);pre-microRNA通過(guò)Ran-GTP依賴(lài)性核漿轉(zhuǎn)運(yùn)子Exportin5從核內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，Dicer酶將pre-microRNA剪切形成一個(gè)不完全配對(duì)的雙鏈的RNA片段即microRNA和microRNA雙體。這種雙鏈很快被引導(dǎo)進(jìn)入RNA誘導(dǎo)復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)中，其中含有Argonaute蛋白，并且成熟的單鏈21～23個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的microRNA分子整合入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)后形成miRNA復(fù)合物(miR ISC)，另一條則可能迅速降解。microRNA是一類(lèi)高度保守的非編碼小RNA，主要通過(guò)結(jié)合靶基因mRNA的5'UTR、編碼區(qū)或3'UTR而在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因的表達(dá)行負(fù)調(diào)控功能。當(dāng)microRNA與靶mRNA完全或幾乎完全配對(duì)時(shí)，則導(dǎo)致mRNA的降解。

目前已知的microRNA主要依賴(lài)以下兩種序列互補(bǔ)原則對(duì)靶基因起負(fù)性調(diào)控作用:一種是miRNA與靶基因mRNA完全互補(bǔ)，此種miRNA的結(jié)合位點(diǎn)通常在靶基因miRNA的編碼區(qū)域或開(kāi)放閱讀框中，從而引起靶基因miRNA的降解。另一種是miRNA與靶基因mRNA不完全互補(bǔ)，該種miRNA的結(jié)合位點(diǎn)通常在靶基因mRNA的3'端非翻譯區(qū)，從而在蛋白質(zhì)翻譯水平上抑制靶基因mRNA的表達(dá)，抑或影響靶基因mRNA的穩(wěn)定性，為絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物中的miRNA發(fā)揮調(diào)控作用途徑。一個(gè)miRNA可有很多靶基因，而每個(gè)基因受多個(gè)miRNA調(diào)控［3］。生物信息學(xué)分析的研究，microRNA在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫反應(yīng)等一系列多種程序中發(fā)揮重要作用，提示細(xì)胞生命活動(dòng)中眾多的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能由microRNA參與調(diào)節(jié)，而每個(gè)microRNA亦可能調(diào)節(jié)數(shù)百個(gè)靶基因［4］。

2 MicroRNA與腫瘤性疾病相關(guān)性研究

miRNA研究的主要貢獻(xiàn)在揭示了其在腫瘤中的潛在作用，microRNA功能類(lèi)似于癌基因或抑癌基因，與腫瘤形成密切相關(guān)。首先，對(duì)線蟲(chóng)和果蠅研究發(fā)現(xiàn)miRNA的功能是調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡，提示它們與腫瘤等增殖性疾病密切相關(guān);其次，許多miRNA的基因被證實(shí)位于基因組中易發(fā)生在伴隨腫瘤發(fā)生的變異區(qū)域;最后，與正常組織相比，腫瘤性疾病或腫瘤細(xì)胞株普遍存在對(duì)miRNA的表達(dá)調(diào)控的異常［5］。研究發(fā)現(xiàn)，編碼調(diào)控miRNA的基因發(fā)生突變、缺失以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控失衡、啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化修飾及結(jié)合蛋白異常等引起miRNA 的異常表達(dá)［6］。

microRNA表達(dá)異常會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的功效，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和分化失去控制，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生miRNA通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而參與了動(dòng)、植物的組織器官發(fā)育、細(xì)胞分化和凋亡等生命活動(dòng)，其表達(dá)異?？蓪?dǎo)致如腫瘤等重大疾病。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)多個(gè)發(fā)揮原癌基因或腫瘤抑制基因作用的miRNA，它們通過(guò)調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。不同腫瘤組織microRNA的表達(dá)譜存在明顯差異，如microRNA表達(dá)的數(shù)量和豐度，另一重要方面表現(xiàn)在某些腫瘤中上調(diào)表達(dá)的microRNA，在其他腫瘤中可能表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，提示microRNA在不同組織條件下行使了癌基因或抑癌基因的不同功能。此外，有些microRNA表達(dá)具有組織特異性，如miR-122僅在肝臟中表達(dá)［7］。而miRNA-21在多種腫瘤中存在表達(dá)異常，例如miRNA-21在卵巢癌［8］的腫瘤組織的表達(dá)水平則明顯下調(diào)，而在白血?。?］、乳腺癌［10］等腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)。說(shuō)明同一種miRNA在不同的組織中(如腫瘤)所起的作用明顯不同甚至截然相反，即表現(xiàn)為同向或者雙向的差異表達(dá)。

腫瘤本質(zhì)上是一種多基因異常疾病，通過(guò)激活一種或多種原癌基因的表達(dá)及抑癌基因的突變?nèi)笔亩鼓[瘤細(xì)胞逃避了正常生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，自主進(jìn)行增殖和侵襲、出現(xiàn)惡性表型。因此miRNA與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后存在著密切的聯(lián)系。

3 血清microRNA:新一代腫瘤標(biāo)志物

尋找腫瘤標(biāo)志物并對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)一直都是癌癥研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。作為新的切入點(diǎn)，microRNA(miRNA)為癌癥的診斷與治療開(kāi)辟了新途徑［11］。血清microRNA作為腫瘤診斷和預(yù)后的標(biāo)志物，可應(yīng)用于早期腫瘤的檢測(cè)，且檢測(cè)損傷小、靈敏度高、穩(wěn)定性好［12］。miRNA幾乎參與了腫瘤發(fā)生的所有重要的信號(hào)通路，參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。

Chen等［13］應(yīng)用Solexa技術(shù)對(duì)健康人和肺癌、直腸癌、糖尿病患者血清中所有小RNA(＜30nt)進(jìn)行測(cè)序證明了血清中確實(shí)含有大量的miRNA，不論健康人或患者血清中都存在大量的 miRNA以及 mRNA碎片、rRNA碎片等。Resnick等［14］研究比較了正常人和卵巢上皮癌患者的血清中miRNA表達(dá)譜，指出miR-21、miR-92和miR-93是療效評(píng)估的潛在生物標(biāo)記物，在腫瘤患者血清明顯過(guò)度表達(dá)。Lawrie等［15］通過(guò)比較研究彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)患者和正常人血清中與腫瘤相關(guān)的miR-155、miR-210和miR-21水平，發(fā)現(xiàn)患者血清中的這些miRNA水平較正常人高，而且認(rèn)為高miR-21表達(dá)水平與未發(fā)生復(fù)發(fā)的存活率有關(guān)。由此指出了miRNA可作為區(qū)分DLBCL和其他腫瘤新的非侵入性診斷標(biāo)志物。Gilad等［16］采用逆轉(zhuǎn)錄定量 PCR對(duì)健康人和結(jié)腸直腸癌(CRC)患者血清中miRNA進(jìn)行檢測(cè)評(píng)價(jià):與健康人相比，CRC患者血清中有11種miRNA具有明顯變化。從而提出了篩查CRC的新選擇:血清游離miRNA作為血清腫瘤標(biāo)志物。

總之，通過(guò)分析人體正常組織與不同腫瘤組織microRNA表達(dá)譜的差異，有望篩選到特異性好、靈敏度高、可作為特定腫瘤分子標(biāo)志物的microRNA。近來(lái)的研究明確表明，血清中含有來(lái)自于各種組織器官的游離miRNA，這些血清miRNA表達(dá)譜可以作為疾病診斷新的血清標(biāo)志物，并且其可能比目前所應(yīng)用的腫瘤和其他疾病的早期診斷方法更為敏感及特異。

4 問(wèn)題與展望

由于miRNA幾乎參與了腫瘤發(fā)生和發(fā)展的每一步過(guò)程，所以miRNA在腫瘤的診斷、預(yù)后、對(duì)化療藥物的療效預(yù)測(cè)以及治療的新靶點(diǎn)方面均有很好的應(yīng)用前景。目前腫瘤領(lǐng)域的分子標(biāo)記主要表現(xiàn)在DNA和RNA水平，但是miRNA因其特殊的穩(wěn)定性及特異性已顯示了其特有的優(yōu)越性。但血清miRNA作為新興的腫瘤分子標(biāo)志物距離臨床應(yīng)用還有一定距離。尋找和驗(yàn)證各種腫瘤的特異性miRNA是我們首先需要解決的問(wèn)題，如質(zhì)控和診斷閥值等都有待進(jìn)一步確定，為建立適合臨床應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)體系建造基礎(chǔ)。除此之外，血清miRNA的功能還需繼續(xù)研究探索。血清miRNA的出現(xiàn)為腫瘤標(biāo)志物的研究開(kāi)辟了新的途徑，隨著研究深入，血清miRNA在人類(lèi)疾病診療中的應(yīng)用將會(huì)取得更多碩果。

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