成國濤 周 嬋 侯春春 徐 水

(西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶北碚 400716)

血液在正常情況下自己會自動從流動態(tài)變?yōu)椴涣鲃拥哪z態(tài)，正是依賴于血液這一性質(zhì)，動物體才不會因為小小的出血而喪生。但這一保護機制有時候卻會給我們帶來麻煩，例如，它會在正常的人體內(nèi)形成血栓，從而造成心腦血管方面的疾病;還有，我們在血液透析的時候不希望血液凝固。因此，抗凝血類藥物一直是我們孜孜以求的。隨著人工器官、組織活性生物材料和裝置的迅速發(fā)展，對生物醫(yī)用材料的抗凝血性要求也越來越高。凡是與血液直接接觸的生物醫(yī)用材料，如人工心臟、人工血管、人工心血管的輔助裝置及各種進入或留置血管內(nèi)與血液直接接觸的導(dǎo)管、功能性支架等醫(yī)用裝置等，都要求與血液接觸后不引起血漿蛋白的變性，不破壞血液的有效成分，不導(dǎo)致血液的凝固和血栓的形成，即對材料的抗凝血性都有一定的要求[1-3]。因而，如何提高生物醫(yī)用材料的抗凝血性是內(nèi)植性高分子生物材料較為活躍的一個研究領(lǐng)域。

絲素蛋白是一種天然蛋白質(zhì)，因其良好的機械性能、生物相容性和易于加工等特點，在組織工程材料中得到越來越廣泛的研究與應(yīng)用[4]。近年來，國內(nèi)外以絲素蛋白為素材，開展了抗凝血劑和抗凝血材料的研究[2-3]。本文擬對改性絲素蛋白作為抗凝血材料的抗凝血機理、制備方法及其研究新進展進行概述。

1 改性絲素抗凝血材料研究進展

1.1 硫酸化絲素

通過對絲素蛋白的結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，絲素包含有三類蛋白:重鏈蛋白(H-鏈，350 kDa)、輕鏈蛋白(L-鏈，25 kDa)和P25蛋白(30 kDa)。這三類蛋白的比例是H-鏈∶L-鏈∶P25=6∶6∶1。在H-鏈蛋白中主要是Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser這樣的氨基酸排列[5]，其中Ser之間的距離，與目前廣泛使用的抗凝素—肝素中有抗凝血作用的重要基團硫酸基的距離十分相近。對肝素抗凝作用機制的研究表明，肝素類藥物本身不具有直接的活性，其抗凝作用在于肝素分子中的葡糖胺單元中含-NH-SO3-基團，該基團可與抗凝血酶(antithrombin，ATIII)特異地結(jié)合，從而使抗凝血酶的構(gòu)型發(fā)生改變，暴露出活性中心，使血漿中的凝血因子IIa(凝血酶)，IXa，Xa，XIa和XIIa等失去活性[6]。因此，在其他材料中構(gòu)建類似的結(jié)構(gòu)或引入-NH-SO3-基團，該材料就具備抗凝血功能。研究表明，在其他材料中引入硫酸根或磺酸基團，可以不同程度的改善材料的抗凝血性[7-8]。因此，若能在絲素蛋白Ser殘基上引入硫酸基或磺酸基，制造出類似肝素的結(jié)構(gòu)，則可賦予絲素抗凝血作用。

日本科學(xué)家[9]的研究工作證實了這一點。用濃硫酸在一定溫度下處理絲素水溶液一定時間，用NaOH中和后，將硫酸化的絲素溶液透析脫鹽，經(jīng)冷凍干燥后得到硫酸化絲素粉。用傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜檢測硫酸處理的絲素被導(dǎo)入硫酸基的情況，結(jié)果表明絲素蛋白分子中的酪氨酸或絲氨酸的羥基被硫酸酯化，形成的硫酸酯基在1100～1400 cm-1處有強烈吸收峰，說明絲素蛋白中被導(dǎo)入了硫酸基。將抽出的血液注入試管，在5 min內(nèi)，血液就自動凝結(jié)，而在添加了硫酸化絲素粉的試管中的血液，即使經(jīng)過2 h以上，也不產(chǎn)生凝固反應(yīng)，從而說明了硫酸化絲素蛋白可以使血液的凝固時間延長，但較肝素的抗凝活性低。

為了提高硫酸化絲素的抗凝性，日本的Tamada Y.用氯磺酸代替硫酸進行了硫酸化絲素蛋白的制備，并對其凝血性能進行了測試[7，10]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用氯磺酸代替硫酸制備的硫酸化絲素，其抗凝活性提高了100倍。但是即便如此，它的活性仍然遠遠不及肝素。通過Tamada Y.的研究分析發(fā)現(xiàn)，絲素硫酸化接枝反應(yīng)主要發(fā)生在絲氨酸和酪氨酸殘基上。氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)硫酸化主要發(fā)生在H鏈，硫酸化絲素仍然保持絲素分子的結(jié)晶區(qū)。硫酸根接枝量隨反應(yīng)時間的延長而提高，酸量滴定法測得其最大硫酸根接枝量為1.0 m mol/g，硫酸化效率為66.7%。進一步的研究分析表明硫酸化絲素的抗凝血性主要取決于硫酸根量，表明硫酸根的引入導(dǎo)致了絲素蛋白的抗凝血。

除用氯磺酸硫酸化絲素外，李圣春等用吡啶三氧化硫硫酸化絲素，制備了水溶性的硫酸化絲素抗凝血材料，并對其抗凝血性能進行了檢測[11]。結(jié)果表明，處理6h后含硫量達到最大值(1.26 m mol/g)，比 Tamada Y.報道的最大含硫量(1.0 m mol/g)高出25%。但遺憾的是，抗凝血效果依然不及肝素。以上研究表明，影響硫酸化絲素抗凝血性的關(guān)鍵在于硫酸根的接枝量，由于硫酸化接枝反應(yīng)主要發(fā)生在絲素蛋白分子中的絲氨酸和酪氨酸殘基上，而這兩種氨基酸在絲素中的含量只有25%左右，這是影響硫酸根和磺酸根接枝量，進而影響抗凝效果的根本原因。

小直徑血管移植失敗的一個重要原因是其腔內(nèi)表面不能及時得到內(nèi)皮細胞(ECs)流而容易形成血栓，如果支架能很好的抗凝血以等待血管細胞生長形成光滑的腔內(nèi)表面將有望解決上述問題。Haifeng Liu利用靜電紡絲技術(shù)將氯磺酸處理過的絲素蛋白制成絲素納米支架[12]，其抗凝血性和相容性的體外評價結(jié)果表明，硫酸化納米絲素支架的抗凝血性顯著增強，血管細胞(內(nèi)皮細胞ECs和平滑肌細胞SMCs)對該支架顯示出很強的粘附能力且增殖良好，這對血管組織的成功重建意義重大。

自然界除桑蠶(因家蠶取食桑葉稱為桑蠶)外，還有很多非桑蠶也吐絲營繭，如取食柞樹葉的柞蠶(Antherea pernyi)，取食蓖麻葉的蓖麻蠶(Philosamia cynthiaricini Boisduval)，以殼斗科柞屬植物的葉為食的天蠶(Antheraea yamamai Guerin-Meneville)和取食楠木葉的琥珀蠶(Antheraea Assama)等。這些非桑蠶的繭和絲和桑蠶繭絲具有相似的性質(zhì)和用途，因而受到廣泛的關(guān)注和研究。Kasoju，N等用琥珀蠶絲絲素作為基材制作了功能支架，并對支架表面進行硫化修飾以期改善材料的血液相容性。掃描電鏡(SEM)結(jié)果顯示硫化對支架的架構(gòu)沒有影響，熱重分析(TGA)和親水性實驗結(jié)果表明支架的熱穩(wěn)定性和親水性得到增強;體外溶血實驗，蛋白吸附和血小板粘附實驗結(jié)果表明該支架的血液相容性明顯改善;體外細胞毒性測試結(jié)果表明該支架無毒，可支持細胞粘附和生長[13]。

1.2 中藥活性成分改性絲素

川芎嗪，化學(xué)名為2，3，5，6-四甲基吡嗪(TMP)，是活血化淤中草藥川芎的主要有效成份之一，現(xiàn)在已可人工合成。臨床治療及藥理研究表明川芎嗪具有改善微循環(huán)、抑制血小板聚集、防止血栓形成等作用，并且從上世紀70年代起已成為國內(nèi)臨床治療心腦血管病的常用藥物。連小潔等嘗試用川芎嗪及其衍生物對絲素進行改性。首先在川芎嗪的側(cè)鏈進行結(jié)構(gòu)修飾引入活性基團羥基，然后通過酯化反應(yīng)引入雙鍵，將得到的中間體進一步在無引發(fā)劑條件下接枝聚合在絲素材料表面。結(jié)果表明，和未改性絲素相比，改性后的絲素部分凝血活酶時間(APT T)延長，同時在富血小板血漿中培養(yǎng)30min后未發(fā)現(xiàn)有粘附的血小板，說明川芎嗪衍生物改性絲素材料的體外抗凝血活性有所改善[14]。她還將川芎嗪結(jié)構(gòu)修飾得到的化合物接枝到聚丙烯酸(PAA)上，提高其穩(wěn)定性，然后與絲素共混制備共混膜，結(jié)果同樣獲得了抗凝效果不錯的抗凝血材料[15]。

Song W.等將原兒茶醛(活血化瘀中草藥丹參的主要活性成分)接枝聚合在絲素蛋白表面，結(jié)果表明改性后的絲素蛋白材料抗凝血性能有了明顯提高，而且細胞親和力得到增強[16]。利用活血化瘀中草藥的活性成分對絲素蛋白進行改性修飾以其提高其抗凝血性的方法，為我們在抗凝血絲素材料的研究上提出了新的思路。但中草藥改性絲素抗凝血材料的抗凝血原理和抗凝機制目前還未見報道。

1.3 肝素化絲素抗凝血材料

肝素本為抗凝血劑，將肝素固定在絲素材料表面或混入絲素中對絲素進行改性，可制備抗凝血材料。馮桂龍等以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(簡稱EDCI)為縮合劑對改性絲素/膠原膜進行了肝素固定化，肝素固定化的絲素改性膠原膜具有良好的抗凝血性[17]。程忠玲選用酶法制備的膠原與肝素化膠原共混，采用戊二醛作為交聯(lián)劑，在25℃、相對濕度為65%的環(huán)境下干燥72 h，制備了肝素化膠原/絲素共混膜。共混膜的活化部分凝血活酶時間(APT T)、凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)分別超過150s、200s、50s[18]。葉勇等利用等離子體處理技術(shù)使絲素膜表面被激活，以戊二醛作為交聯(lián)劑，接枝肝素分子進行絲素膜表面抗凝血性修飾。單因素優(yōu)化實驗結(jié)果顯示:經(jīng)等離子體和戊二醛處理后的絲素膜與肝素溶液的較好反應(yīng)條件為pH 1.5、40℃、4 h，該條件下絲素膜表面肝素含量為37.62μ g/g。經(jīng)體外凝血試驗檢測，接枝肝素分子后的絲素膜具有較強的抗凝血活性;經(jīng)穩(wěn)定性試驗分析，肝素與絲素膜結(jié)合穩(wěn)定牢固不易被洗脫，提示其結(jié)合方式為共價鍵結(jié)合[19]。

除純絲素肝素固定化外，絲素共混材料的肝素共混和固定化也可制備抗凝血材料。She等將肝素在溫和的條件下加入絲素/殼聚糖支架中。各種分析結(jié)果表明，加了肝素的絲素/殼聚糖支架維持了絲素基材支架的多孔性和良好的機械性能，并有效增強了其抗凝性，導(dǎo)致支架可以與血液兼容[20]。為控制肝素的釋放，延長材料的抗凝血作用時間，Xiu-Ying Liu等在聚氨酯和絲素蛋白共混膜中載入肝素制備了肝素緩釋體系。該體系中，肝素的釋放率和累計釋放比例可由膜上載入的肝素量，絲素蛋白與聚氨酯的組成比例以及膜厚度來控制。增加膜厚度，提高肝素載入數(shù)量及提高膜中的絲素蛋白量可以更慢更持久的釋放肝素。復(fù)合膜保持了肝素高的生物活性和持久的抗凝血酶時間，凝血時間實驗表明該復(fù)合薄膜具有良好的血液相容性[21]。

Shudong Wang等利用靜電紡絲技術(shù)制備了兩種靜電紡肝素改性絲素納米材料，體外凝血測試結(jié)果表明該絲素納米材料的抗凝血性遠高于純絲素。此外，L929成纖維細胞和EVCs在肝素改性絲素納米材料上的擴展增殖好于純絲素材料，而且未觀察到巨噬細胞，中性粒細胞和淋巴細胞，表明該材料在機體內(nèi)不會引起嚴重的炎癥[22]。

1.4 接枝2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽酰的絲素蛋白材料

Furuzono等用2-甲基丙烯酰氧乙基異氰酸酯的乙烯基對絲素進行改性，然后采用偶氮聚合引發(fā)劑將其接枝在改性的絲素上。接枝2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽酰的高分子材料具有類磷脂結(jié)構(gòu)，其表面可強烈吸附血液中的磷脂分子，在材料表面形成單層完全覆蓋的類似生物體表面的磷脂層，使血漿蛋白和血細胞與材料表面的相互作用變?nèi)?，從而有效抑制材料表面的血漿蛋白吸附、血小板黏附以及血小板的活化，阻礙血栓的發(fā)生。體外血小板黏附實驗證實，接枝2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽酰的絲素比對照絲素的血小板黏附顯著降低。同時發(fā)現(xiàn)接枝率在6.9%，17.2%和26.3%的絲素三者之間的血小板黏附數(shù)量并無顯著性差異，說明在所研究的范圍內(nèi)血小板黏附數(shù)量與2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽酰接枝到絲素上的數(shù)量沒有關(guān)系[23]。

1.5 接枝褐藻多糖硫酸酯的絲素蛋白材料

褐藻多糖硫酸酯是從褐藻中分離出的一種獨特種類的硫酸基多糖，是目前除肝素外研究較多的有效抗凝血劑之一。程忠玲等利用等離子體技術(shù)在其表面上接上氨基，采用戊二醛為交聯(lián)劑，將褐藻多糖硫酸酯固定在絲素膜的表面上?？鼓钚栽u價結(jié)果表明:改性絲素膜的APT T和TT比未處理的純絲素膜、NH3等離子體處理絲素膜分別延長35s和4s[24]。利用X射線電子能譜進行絲素蛋白膜表面元素分析，發(fā)現(xiàn)APT T、T T隨著改性絲素膜表面硫含量的增加而增加，說明接枝膜的抗凝血活性依賴于其表面的抗凝血劑的硫酸根含量[25]。褐藻多糖硫酸酯是利用其帶有的硫酸基等負電荷基團與HCⅡ結(jié)合，而形成的復(fù)合物又與凝血酶結(jié)合，從而在空間結(jié)構(gòu)上阻礙了凝血酶的活性。同時褐藻多糖硫酸酯也結(jié)合在纖維蛋白原的堿性氨基酸殘基如精氨酸或賴氨酸上，使凝血酶無法接近并作用于纖維蛋白原，因此，抗凝血主要是增強HCⅡ?qū)δ富钚缘囊种坪鸵种评w維蛋白原的凝結(jié)來延長凝血時間[26]。

1.6 磺酸化絲素

顧晉偉等首次采用二氧化硫等離子體處理絲素薄膜，在其表面引入磺酸基團;同時用氨氣等離子體處理絲素蛋白膜后在表面接入氨基，利用1，3-丙磺酸內(nèi)酯與氨基的反應(yīng)在材料表面接枝磺酸基團。X射線電子能譜的分析結(jié)果表明，絲素膜表面僅有微量的硫元素(0.32%)，經(jīng)過二氧化硫等離子體處理后絲素膜表面的硫元素含量上升到4.03%。全反射紅外光譜在1 160 cm-1附近出現(xiàn)一個新的吸收峰，歸于磺酸基團-SO3H中S=O鍵的對稱伸縮振動。體外抗凝血實驗結(jié)果表明，APT T和T T分別超過150 s和90 s，而PT變化不大，表明材料表面接入的磺酸基團與部分凝血活酶時間所涉及的凝血因子產(chǎn)生相互作用，從而抑制其中的凝血因子的活性，而且對纖維蛋白原也有相當?shù)囊种谱饔茫Y(jié)果表明二氧化硫等離子體改性的絲素蛋白材料在抗凝血性方面具有優(yōu)越的性能[27]。

在實用化的醫(yī)學(xué)組織工程方面，李少彬等采用低溫等離子體技術(shù)處理普通聚四氟乙烯人工血管內(nèi)表面，將制備并濃縮到一定濃度的絲素蛋白溶液均勻涂覆到人工血管內(nèi)表面，再次使用低溫等離子體技術(shù)對人工血管內(nèi)表面的絲素膜進行磺酸化處理。以普通聚四氟乙烯人工血管為對照，進行接觸角及磺酸化效果檢測。結(jié)果表明:氬氣低溫等離子體處理前后接觸角分別為87.7°和65.1°，涂覆絲素蛋白后接觸角為106.2°，二氧化硫低溫等離子體處理后接觸角為92.9°;X射線光電子能譜儀檢測對照絲素膜表面僅有微量的硫元素(0.12%)存在，經(jīng)過二氧化硫等離子體處理后絲素表面的硫元素含量上升到2.89%;X射線光電子能譜圖中的S2p峰擬合曲線顯示了復(fù)合血管表面的S原子主要是磺酸基團(-SO3H)，說明實驗已制備出理論上具有抗凝血性能的血管[6]。

2 展望

綜上所述，通過對絲素蛋白進行各種修飾改性，可以使本身不具有抗凝血效果的絲素蛋白獲得抗凝血性，這大大提高了絲素在組織工程材料方面的應(yīng)用潛力和價值。部分研究已將其應(yīng)用在人工血管的制備上[6，12]，血液相容性和適應(yīng)性良好，為絲素抗凝血組織工程材料的進一步應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。但是，血液凝固機制十分復(fù)雜，改性絲素該凝血材料的抗凝血機理，以及抗凝材料表面微觀結(jié)構(gòu)與抗凝血性之間關(guān)系的研究還很不完善，尚需進一步研究。隨著抗凝血機制和改性方法的深入研究，相信絲素蛋白材料在抗凝血劑和抗凝血材料領(lǐng)域?qū)⒂泻艽蟮膽?yīng)用潛力。

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