肖 勇 范志勇 李玉蓮 陳永輝 倪世宏 張勝利

湖南農業(yè)大學飼料安全與高效利用教育部工程研究中心；湖南農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，長沙 410128

初情期是動物從出生開始發(fā)育到獲得繁殖能力的標志。雌性動物丘腦下部，垂體及卵巢分泌的激素在功能和調節(jié)上相互作用構成的完整生殖內分泌體系(下丘腦—垂體—卵巢軸)在生殖調節(jié)活動中起著核心作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物的營養(yǎng)狀況與其生殖機能存在密切聯(lián)系，直接影響到初情期的啟動，其中體重似乎比年齡的的影響更大。對于現(xiàn)代后備母豬而言，體脂含量和能量代謝信號是啟動動物初情期和維持生殖機能的重要因子，一個最低的體脂含量是母豬進入初情期的必備條件。因此，尋找聯(lián)系機體能量代謝與神經內分泌系統(tǒng)之間的信號因子，揭示其作用機理己成為當今生殖生物學與動物營養(yǎng)學領域的重要課題。Leptin(瘦素)的發(fā)現(xiàn)為人們充分認識和理解其在機體營養(yǎng)狀態(tài)和生殖機能之間聯(lián)系紐帶的重要性提供了分子基礎。本文主要就目前生物活性物質在動物初情期啟動調控作用的研究中，有關Leptin對下丘腦－垂體－性腺軸（卵巢）的調控效果及其機理進行綜述，以期為今后有關后備母豬初情期啟動（性成熟）及經產母豬產后發(fā)情過程中Leptin的作用機制、途徑及其與機體營養(yǎng)狀況、內分泌代謝之間的聯(lián)系方面的研究提供參考。

1 Leptin的生物學特性

Leptin由167個氨基酸殘基組成，是肥胖基因的表達產物，分子量約16KD。各種哺乳動物的Leptin有高度保守性，其中人和豬的Leptin氨基酸殘基同源性達84%，牛和豬高達93%，豬和小鼠也有87%。據(jù)研究，Leptin主要由脂肪組織分泌，但包括胎盤、大鼠的骨骼肌、大鼠的胃、人的乳腺上皮細胞、人和鼠的腺垂體在內的其它組織也能生成。目前 ，應 用 RT-PCR、Northern-B1otting、Southern-B1otting等方法已克隆出了人、鼠和豬的Leptin蛋白基因。Zhang等從大鼠脂肪組織中克隆了瘦蛋白基因并進行了序列分析，鼠Leptin蛋白基因DNA全長219kb，5’端有114bp的引導序列，其后為501bp的開放閱讀框，3’端為2237bp的非編碼序列，5’和3’端的非編碼序列有50bp的重復。戴茹娟等（2000）報道了豬Leptin蛋白基因全長序列為3277bp。

在瘦肉率性狀上有顯著差異的不同品種豬的Leptin蛋白基因的序列大小不同，瘦肉型豬的Leptin蛋白基因為412kb，脂肪豬的Leptin蛋白基因為313 kb。戴漢川等（2006）不僅對草魚1eptin基因進行了分離鑒定，而且還使其在巴斯德畢酵母中得以表達。

2 Leptin與動物初情期啟動

2.1 Leptin和動物初情期的相關性

研究發(fā)現(xiàn)，初情期的啟動與下丘腦和性腺類固醇激素之間的反饋有關，是由于動物生長發(fā)育到一定階段，其下丘腦對性腺類固醇激素的負反饋敏感性降低，使GnRH分泌增加，同時垂體對GnRH的敏感性及性腺對GnRH的敏感性增加，從而啟動初情期，在雌性動物表現(xiàn)為LH水平升高，雌激素和孕酮水平上升。很早科學家們就注意到動物的營養(yǎng)狀況與初情期啟動有關，在初情期啟動的地位上體重或者說體組成（體脂）似乎比年齡的作用更大，當動物長期處于營養(yǎng)不良或過度消瘦缺乏體脂的情況下，短壽命的動物將會終生都不出現(xiàn)初潮，而長壽命動物的初情期也會推遲直到有充足的能量被利用的時候出現(xiàn)。由于以往缺乏有力的分子證據(jù)來解釋上述現(xiàn)象，所以人們對于營養(yǎng)或能量儲備與初情期啟動之間的關系一直不清楚，直到Leptin的發(fā)現(xiàn)才奠定了脂肪和生殖之間聯(lián)系的分子基礎。這一發(fā)現(xiàn)既與已發(fā)現(xiàn)的Leptin擔負著把身體外周能量貯存和身體營養(yǎng)狀態(tài)的信息傳遞給中樞神經系統(tǒng)，調節(jié)神經內分泌活動的作用吻合，同時也正好印證了傳統(tǒng)初情期啟動的假說。

Leptin對初情期啟動具有重要的作用。據(jù)研究，Leptin能促進哺乳動物初情期的啟動和下丘腦一垂體－性腺軸的成熟，特別是對初情期前動物GnRH分泌的刺激，可能是其影響初情發(fā)生的重要途徑。初情期前注射Leptin的正常大鼠的初情期比未注射組提前了3天，而ob基因缺陷的大鼠由于不能分泌Leptin而顯得過度的肥胖和不育，不過如果補充注射Leptin也能恢復它的生育能力。給正常雌性小鼠注射重組人Leptin，發(fā)現(xiàn)Leptin處理組比對照組提前獲得繁殖力Leptin處理的小鼠的生殖道的成熟比對照組早，性腺和生殖器官的重量明顯的重于對照組。Quinton等在研究Leptin和初情期啟動的調節(jié)時發(fā)現(xiàn)，Leptin對初情期的調控與Leptin和其可溶性受體的結合性有關。隨著年齡的增加，Leptin的粘性活性 (Leptin Binding Activity,LBA)不斷變化，出生時較低，初情期以前逐漸上升，初情期以后則逐漸下降到成年水平，這有利于長形受體為Leptin傳遞生物信號到神經中樞激活繁殖軸，這和其它哺乳動物初情期啟動時Leptin的水平變化相吻合。

2.2 Leptin對下丘腦－垂體－性腺軸的調控

Leptin作為一種中樞神經調節(jié)激素，其受體廣泛分布在下丘腦中。在下丘腦，Leptin的受體主要存在與 ARC、 室旁核 （Paraventricu1ar Nuc1eus，PVN）和下丘腦的底部，定位在神經肽Y CNeuropeptide Y, NPY)和阿 片肽 C （opioid peptides)神經元上。Lebretho等通過對15日齡初情期前的雄性大鼠下丘腦后交叉的細胞進行離體實驗時發(fā)現(xiàn)，Leptin能有效通過刺激古柯堿苯丙胺調節(jié)轉導物(Cocaine and Amphetam ine-Regu1ated Transcript,CART)(一種新的厭食肽)來促進GnRH的釋放。進一步的研究證實，下丘腦ARC內的NPY也是Leptin作用的靶目標，后者能抑制GnRH和雄性大鼠的LH分泌，而且存在NPY的劑量相關性。在研究Leptin在垂體中的功能時發(fā)現(xiàn)，Leptin受體大量存在于垂體促性腺細胞和促生長細胞內，69%的促生長細胞的神經末梢上和90%的促性腺細胞的神經突起上呈陽性反應；而且，大部分垂體前葉細胞中不僅含有Leptin受體，而且還表達Leptin本身，這表明Leptin是通過自分泌和旁分泌的方式來調控垂體的功能進而影響FSH和LH的分泌。

Leptin對性腺的調控主要通過垂體－性腺軸或直接作用于性腺軸兩條途徑。研究表明，注射Leptin能明顯降低大鼠的排卵率。離體條件下，大鼠卵巢同時灌注Leptin和LH與單獨使用LH相比，使用Leptin的排卵率顯著低于單獨使用LH，這說明在抑制排卵方面是Leptin直接作用于卵巢。但有研究發(fā)現(xiàn)，Leptin能夠明顯地促進排卵前卵母細胞的減數(shù)分裂數(shù)，促進卵母細胞成熟。究其原因可能在于Leptin能抑制細胞內的IGF-I的促進物，削弱了IGF-I的生物學作用 （IGF-I是LH和FSH刺激卵泡發(fā)育的一種介導物質），最終影響了LH和FSH對卵泡發(fā)育影響，但不影響雌激素和孕酮的分泌。這也部分解釋了Leptin能抑制排卵和正?；蛐椭羞^度的肥胖也會損傷生殖系統(tǒng)的原因。體外培養(yǎng)條件下，研究發(fā)現(xiàn)1eptin能有效抑制FSH和地塞米松共同對類固醉激素合成的促進作用，抑制孕烯醇酮(pregneno1one)、孕酮(pregesterones)和20-α 羥 基-4 孕 烯-3孕 酮 （20α－h(huán)ydroxy-4-pregnen-3-one)的合成，這種抑制部分地減少了腎上腺鐵氧還原蛋白 (adrenodoxin，P450細胞色素細胞色素系統(tǒng)酶之一)的合成。Leptin這種導致鞘膜細胞中糖皮質激素受體的轉錄活性降低進而減少生殖類固醇激素生成的作用，一定程度上也說明它是調節(jié)體內類固醇激素平衡的重要因素之一。用免疫組化的方法來檢測不同時期的小鼠睪丸中的ob-R的表達情況，發(fā)現(xiàn)隨著日齡的增長，ob-R的表達發(fā)生變化，5日齡的小鼠主要在A型精原細胞中表達，在20～30日齡主要在精母細胞中表達，而到了成年以后主要在精細管上皮周期的IX期和X期精母細胞中表達。這說明，Leptin的分泌具有性別差異，是受到性腺、X、Y染色體以及體脂等多種因素的影響，呈現(xiàn)出雌雄兩種不同的水平差異性。

2.3 Leptin對生殖激素分泌的調控

下丘腦ME含有分泌GnRH的神經末梢，而ME缺乏血腦屏障，這就為 Leptin不經過轉運機制而直接作用于GnRH神經元提供了解剖基礎。Lebretho通過對15日齡初情期前的雄性大鼠下丘腦后交叉細胞進行離體試驗時發(fā)現(xiàn)，Leptin能夠有效刺激GnRH的釋放，但值得注意的是低濃度Leptin(10-12－10-10 mo1/L)使培養(yǎng)的正中隆起(ME)-ARC組織分泌GnRH增加，而高濃度Leptin(10-6 mo1/L)則使GnRH分泌減少，提示可能存在負反饋機制。免疫組化分析也證實，大鼠ARC等部位可表達Ob-R mRNA及其蛋白質。不過原位雜交顯示，雄猴大腦的脈絡叢、紋狀體及下丘腦等部位有Ob-R mRNA分布，但以ARC及VMN等部位為最高，但在GnRH神經元上并未發(fā)現(xiàn)Ob-RmRNA表達，故推測Leptin影響GnRH分泌過程并非Leptin的直接作用所致。Magni等用RT-PCR法，從GT1-7細胞(一種可以分泌GnRH的無限細胞系)中檢出了Ob-R的mRNA，證實這些細胞可以表達Ob-R蛋白質，而且將Leptin加入該細胞培養(yǎng)液，盡管GnRH釋放增加，但GnRH的基因表達卻無變化。這說明，Leptin可能與GnRH神經元上的Ob-R結合而直接刺激GnRH的分泌。

Suter研究發(fā)現(xiàn)，Leptin能從促使雌性獼猴初情期前的GnRH的分泌逐漸過度到初情期啟動時GnRH分泌的狀態(tài)，同時促進了FSH和LH的分泌。研究證實，F(xiàn)SH和Leptin存在明顯的正相關，Leptin的急性變化能顯著地影響LH的分泌脈沖，把Leptin的抗血清注射到大鼠的心室會引起LH分泌的減少，Leptin處理的動物血漿中LH和FSH水平比一般處理的要高一些，這一點在其它動物、如小鼠、大鼠等)也得出相似的研究結果。對兒童的研究證實，在初情期出現(xiàn)之前，Leptin有一個明顯的上升過程，這個時期的Leptin水平比基礎水平高一倍，然后LH會隨之出現(xiàn)上升。這種時間上的先后關系也說明了Leptin與初情期啟動的密切關系。

Leptin對動物體內性腺激素的分泌也具有重要的影響，是維持正常的性腺激素水平的重要因素。體外培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)，Leptin直接作用于卵巢時并不影響促卵泡素（FSH）和LH分別對E2和孕酮的刺激，但是抑制了胰島素樣生長因子一I（Insu1in-1ike Grow rthFactor-I,IGF-I)誘導E2分泌的作用。研究表明，Leptin能夠通過抑制FSH和轉化生長因子－β（TGF－β）共同誘導芳香化酶細胞色素P450 (Aromatase cytochrome P450)活性和mRNA的表達來減少E2的產生，但是不影響FSH單獨刺激的E2水平。上述結果提示，Leptin可能直接作用于垂體前葉的LH細胞和FSH細胞調節(jié)激素釋放，同時垂體前葉細胞內Leptin的分泌和功能可能受自分泌與旁分泌機制的調節(jié)，這有待進一步研究證實。

Leptin對卵巢和睪丸性類固醇激素的分泌也具有影響。研究表明，Leptin對卵巢激素的分泌有抑制作用，有生育力婦女的顆粒細胞與Leptin(10－100ng/m1)一起培養(yǎng)，顯著抑制FSH和IGF-1誘導的雌激素合成。這說明，肥胖婦女血中高水平的Leptin可能干擾優(yōu)勢卵泡雌激素的合成，使得雌激素水平不足以激發(fā)LH釋放，而導致不排卵[28]。有關Leptin對睪丸激素分泌影響的報道不多，有限的研究認為，Leptin不影響人絨毛膜促性腺激素(hCG)誘導的青春期前辜丸組織分泌翠酮，但抑制基礎的或hCG誘導的成年鼠翠丸組織釋放翠酮，說明Leptin對翠酮的調節(jié)與性成熟狀態(tài)有關，還有細胞因子參與。這說明，Leptin對生殖器官作用的機制比較復雜，可能存在著多種激素組成的調控網絡，其機制還有待進一步探討。

3 結語

綜上所述，盡管還存在爭議，但有關Leptin是促進性成熟的重要因素，在動物初情期的啟動上發(fā)揮著重要作用，這一點已達成共識。今后相當長一段時間內，在以下幾方面就Leptin生物學作用開展研究是必要的：⑴對于Leptin循環(huán)水平的動態(tài)變化與初情期的啟動和生殖機能的維持之間的聯(lián)系，以及是否存在啟動初情期的Leptin臨界水平尚未清楚；⑵GnRH神經元上是否存在Leptin受體尚未得到證實；⑶Leptin對下丘腦－垂體－性腺軸（卵巢）的調控機理尚未弄清，對垂體促黃體生成素(LH)和生長激素(GH)分泌的作用途徑還不明確，有待進深入探討。這些問題的解決有助于探明Leptin調控動物初情期以及繁殖軸的分于機理，揭示營養(yǎng)與生殖之間的內在聯(lián)系，可為研究動物整個生殖活動的調節(jié)機理提供新思路，并將動物生殖內分泌學的研究引入更新領域，為發(fā)展動物繁殖營養(yǎng)學奠定理論基礎。同時也可為在生產中應用Leptin調控動物的生殖活動提供理論依據(jù)，特別是在家畜上開展Leptin研究，填補薄弱環(huán)節(jié)，建立提高家畜繁殖效率的新方法，促進畜牧業(yè)發(fā)展方面都具有重要的應用價值。

（略）