吳 衍,熊 前

(公安部南昌警犬基地，江西 南昌 330100)

犬精液冷凍保存技術(shù)在犬種資源的保護(hù)、品種選育和加快育種進(jìn)程等方面具有重要的作用。1780年，意大利生理學(xué)家Spmlanzani首次用犬進(jìn)行人工授精(AI)試驗(yàn)并取得成功。1959年，Seager首次報(bào)道了犬的凍精人工授精試驗(yàn)成功。1965年Har rop和Bendor f等人以牛奶和卵黃-檸檬酸緩沖液稀釋犬精液，在5℃條件下精子存活了數(shù)天。1988年，Bat tista等比較了Tris稀釋液、Test稀釋液、乳糖稀釋液和Pipes稀釋液。從結(jié)果來(lái)看，無(wú)論存活率還是活力和存活時(shí)間Tris稀釋液都最好。之后，人們相繼建立了有關(guān)精液冷凍、品質(zhì)鑒定以及AI的一系列優(yōu)化參數(shù)。世界上一些發(fā)達(dá)國(guó)家的犬冷凍精液與AI研究研究起步早，目前已得到了廣泛應(yīng)用。美國(guó)養(yǎng)犬俱樂(lè)部(AKC)早在20世紀(jì)70年代即投入了大量的資金用于犬的冷凍精液和AI研究，并詳細(xì)制定了冷凍精液生產(chǎn)以及AI各主要環(huán)節(jié)的操作規(guī)程；同時(shí)規(guī)定，從1981年起，只有經(jīng)過(guò)AKC審驗(yàn)合格的配種站才能提供犬的冷凍精液。

我國(guó)在這方面的研究起步較晚，目前尚處于試驗(yàn)研究階段。1985年，潘壽文等對(duì)德國(guó)牧羊犬的凍精及人工授精進(jìn)行研究，輸精9頭母犬，2頭懷孕，平均窩產(chǎn)仔2頭；1991年，王力波等對(duì)德國(guó)牧羊犬的凍精也獲成功，輸精5頭，4頭懷孕，平均窩產(chǎn)仔7頭；1994年，劉海軍等對(duì)德國(guó)牧羊犬凍精進(jìn)行研究，結(jié)論為在最優(yōu)條件下，解凍后精子活力為0.47，復(fù)蘇率52.2%，存活時(shí)間8.23 h，存活指數(shù)1.08，頂體完整率43%。

從國(guó)內(nèi)外研究者的結(jié)果來(lái)看，犬精子冷凍保存的效果不是很好，凍后活力一般在0.4左右，用凍精人工授精后受孕率低，產(chǎn)仔數(shù)少，給犬人工授精技術(shù)的推廣帶來(lái)很大的困難。為了提高冷凍精液的品質(zhì)和受胎率，許多研究者就稀釋液中的添加物進(jìn)行了大量研究，不同程度影響到冷凍精液的品質(zhì)和受胎率。早期經(jīng)典的犬科動(dòng)物凍精稀釋基液有多種，例如脫脂奶乳、Tris等，目前最普遍使用的一種稀釋液是添加適量果糖或者葡萄糖以及20%體積蛋黃的Tris-檸檬酸緩沖液。近年來(lái)，人們也常用經(jīng)濟(jì)、方便的椰子汁來(lái)替代傳統(tǒng)的稀釋液進(jìn)行精液冷凍試驗(yàn)。各種商品化的稀釋液也陸續(xù)在市場(chǎng)上出現(xiàn)并得到人們的認(rèn)可，如德國(guó)Tiefenbach基于Tr is的Tri ladyl，美國(guó)Pennsylvania的C.L.O.N.E.。

1 犬冷凍精液稀釋液的pH值

由于精子代謝很強(qiáng)烈，能量消耗快，同時(shí)因代謝產(chǎn)物積累，改變了精子環(huán)境的pH值，導(dǎo)致某些酶的活性被抑制，致使精子喪失受精能力。因此，稀釋液pH值一定要控制在一定范圍。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)此作了大量研究，精液pH值可因精子代謝及其他原因而變化，當(dāng)精液pH值降低時(shí)，精子代謝與活動(dòng)減弱；反之，因pH值上升，精子代謝與活動(dòng)增強(qiáng)，能量迅速耗竭，存活時(shí)間減少。為維持正常代謝活動(dòng)，精子需要適宜的pH值范圍，犬精子適宜的pH值范圍是6.4～7.0。部分國(guó)外學(xué)者認(rèn)為最佳pH是6.6，國(guó)內(nèi)部分學(xué)者在配制精液稀釋液時(shí)對(duì)pH值未加調(diào)整，這是造成了精子凍后活力降低的重要因素。辛國(guó)省等通過(guò)對(duì)藏獒精液低溫保存稀釋液的pH值研究認(rèn)為,犬的精液低溫保存稀釋液的最適pH為6.5。

2 質(zhì)膜保護(hù)劑

卵黃在低溫保存精液的冷卻過(guò)程中是一類很好的防精子冷休克的物質(zhì),可以使精子質(zhì)膜在冷凍過(guò)程中損壞的磷脂得以修復(fù)。同時(shí)，卵黃還是一種滲透性緩沖劑, 使精子能耐受低滲和高滲脅迫。所以，稀釋液中經(jīng)常添加蛋黃來(lái)作為精子質(zhì)膜的保護(hù)劑，其濃度隨緩沖液中其它組成成分不同而不同。但是蛋黃的應(yīng)用可以引起病原體的廣泛傳播。隨著犬冷凍精液進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)，人們也在尋找卵黃的替代品。抗氧化劑二叔丁對(duì)甲酚(BHT)類物質(zhì)在牛的精子冷凍中對(duì)精子質(zhì)膜具有很好的保護(hù)性,但在犬科動(dòng)物中尚需進(jìn)一步研究。

3 冷凍保護(hù)劑

保存過(guò)程中，精子經(jīng)歷了降溫、凍結(jié)、解凍過(guò)程，其中冰晶形成不可避免地?fù)p傷了精子(李青旺等，2003)。由于冰晶會(huì)導(dǎo)致類脂蛋白變性，破壞細(xì)胞膜相結(jié)構(gòu)、產(chǎn)生機(jī)械損傷，導(dǎo)致精子超微結(jié)構(gòu)破壞、頂體物質(zhì)流失、頂體膜脫落等(Oehninger等，2000)。因此，有效降低大冰晶形成方法就是使用冷凍保護(hù)劑。理想的冷凍保護(hù)劑應(yīng)該具有3方面的特征，即可以快速滲入精子細(xì)胞內(nèi)，對(duì)溫度依賴性低，對(duì)精子毒性小。常用的冷凍保護(hù)劑有甘油、乙二醇、DMSO等。其中甘油應(yīng)用最早，其有利于電解質(zhì)和水結(jié)合，使精子內(nèi)含水蛋白穩(wěn)定,減少冷凍時(shí)細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，降低對(duì)精子的損傷。保護(hù)劑有毒性作用，引起精子超微結(jié)構(gòu)的明顯損害。隨著保護(hù)劑濃度的升高，其對(duì)精子的毒性作用亦隨之增強(qiáng)，冷凍精子復(fù)蘇率會(huì)呈下降趨勢(shì)。乙二醇與甘油相比不僅具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，而且分子量較小，所以具有更高的滲透性，在人、小鼠等的精子冷凍試驗(yàn)中乙二醇都有比甘油更好的保護(hù)效果。但在犬科動(dòng)物中，其效果有很大的差異。Cavalcanti等的試驗(yàn)表明，相對(duì)于甘油，在含有相同濃度乙二醇的稀釋液中，解凍后的精子活率偏低；Soares等發(fā)現(xiàn)，0.25、0.50mol/L的乙二醇與0.80mol/L的精子活率的影響沒(méi)有顯著差異，但是精子在含1.0mol/L的乙二醇的稀釋液中解凍后的活率相對(duì)于前者有很大程度的降低；張志平等對(duì)甘油和乙二醇濃度進(jìn)行了比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4%甘油對(duì)犬精子冷凍效果較好，而且優(yōu)于用5%乙二醇。Mar tins等(2006)也報(bào)道相似結(jié)論。最近，Rota等用低滲膨脹法分別測(cè)定了5%濃度的乙二醇和甘油對(duì)精子解凍后的活力和質(zhì)膜完整性，結(jié)果顯示乙二醇可以使解凍后短期內(nèi)(1～3 h)的精子具有極高的活率和很完整的質(zhì)膜。

在冷凍稀釋液里加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(SDS)也可以提高犬解凍精子的活率和存活時(shí)間。目前商品化的SDS類冷凍稀釋液最常用的有Equex STM Paste和Orvus ES Paste兩種，并且對(duì)提高解凍后精子的活率都有很好的效果。Equex Paste也偶爾見(jiàn)于文獻(xiàn)，但普遍沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯提高精液品質(zhì)的作用。Pena等推測(cè)SDS對(duì)解凍后精子的作用可能與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度有關(guān)。

4 低溫保存犬精液稀釋液的能量物質(zhì)

糖類物質(zhì)不僅可以作為保護(hù)劑保持稀釋液的滲透壓，而且可以在冷凍過(guò)程中為犬精子提供代謝所需要的能量。果糖和葡萄糖是目前最常用的兩種糖，但是，文獻(xiàn)中這兩種糖在稀釋液中的濃度從5mmol/L到120mmol/L不等。Ponglowhapan等的研究結(jié)果顯示，在卵黃一Tr is稀釋液中，70mmol/L的果糖對(duì)精子的冷凍儲(chǔ)藏效果最好，但是相對(duì)于果糖，犬精子更傾向于消耗同濃度條件下的葡萄糖。

5 其他

Michael等研究了添加抗氧化劑對(duì)解凍后精子活率的影響,結(jié)果表明在稀釋液中分別添加維生素C(1.5mmol/L)、乙酰半胱氨酸(1.5mmol/L)、?；撬?0.6mmol/L)、過(guò)氧化氫酶(300 U/mL)等可以不同程度地增強(qiáng)解凍后精子的活率，但是最佳濃度還需進(jìn)一步優(yōu)化。

精液和稀釋液都是營(yíng)養(yǎng)豐富的物質(zhì)，是細(xì)菌微生物孳生的適宜環(huán)境。有研究表明，未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的精液其保存效果非常好，在有細(xì)菌的精液，其保存性因細(xì)菌的種類和數(shù)量不同而異，并且指出大腸桿菌等對(duì)精液保存影響極大，可在短時(shí)間內(nèi)使精子活力、頂體完整率大幅度下降，青霉素、鏈霉素等抗菌物質(zhì)能抑制細(xì)菌的孳生。