熊琪輝（綜述），甘華俠（審校）

（南昌大學(xué)a.研究生院醫(yī)學(xué)部2009級；b.第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，南昌 330006）

糖尿病性腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病患者的重要死因，同時又是導(dǎo)致腎功能衰竭的一個重要疾病。早期診斷DN，有利于提高糖尿病患者的生存率、生活質(zhì)量，減少國家的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。目前尚缺乏更優(yōu)于尿微量白蛋白的檢測指標(biāo)，以更早的發(fā)現(xiàn)潛在的DN人群，早期對其進(jìn)行干預(yù)，改變DN的發(fā)展及預(yù)后。

硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）為廣泛存在于脊椎動物和無脊椎生物組織細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）和細(xì)胞表面的生物大分子，并且是腎小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）的主要構(gòu)成成分。乙酰肝素酶（heparanase，HPA）是一種葡萄糖醛酸內(nèi)切酶，通過特異性降解釋放出多種與HS結(jié)合的活性因子［堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、血小板源性生長因子、白介素－2、肝素輔助因子Ⅱ等］，參與許多病理和生理過程。正常生理條件下，其基因表達(dá)和酶活性受到多種因素調(diào)控，否則其過度表達(dá)會促進(jìn)諸多病理過程發(fā)生，如：腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移、血管形成、炎癥和自身免疫反應(yīng)等。

筆者就近年來國內(nèi)外關(guān)于HPA與DN之間相關(guān)性的研究進(jìn)行綜述，以求進(jìn)一步明確二者之間可能存在的關(guān)聯(lián)。

1 HPA概述

1.1 HPA的發(fā)現(xiàn)

M.H??k等［1］于1975年在鼠肝臟組織中發(fā)現(xiàn)一種降解HS側(cè)鏈的內(nèi)切糖苷酶，這是首次對于HPA存在的報道。但由于該酶的含量低、性質(zhì)不穩(wěn)定，并缺乏一種高效的檢測方法，HPA蛋白的分離純化研究遇到了重重困難。直到90年代后期，澳大利亞C.Freeman等［2］才成功建立了一個能夠快速定量檢測 HPA的方法。隨后I.Vlodavsky等［3－4］的實驗室又分別獨(dú)立完成了HPA cDNA的基因克隆，推動了當(dāng)今對HPA的進(jìn)一步研究。

1.2 HPA的基因定位與結(jié)構(gòu)

HPA基因的單核苷酸全長序列已經(jīng)明確。該基因定位于4號染色體q21.3上，從起始密碼子到終止密碼子全長為40kb，含有12個外顯子和11個內(nèi)含子。啟動子位于AUG上游2.3kb處，全長1 758bp，含有可編碼543個氨基酸多肽的開放閱讀框，相對分子質(zhì)量為61 192，與從血小板中純化的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量相近。N末端有親水側(cè)鏈，17和35區(qū)有降解位點(diǎn)，110－170處有親水基團(tuán)，另外有6個N末端糖基位點(diǎn)。SDS－PAGE分析［5］證實純化的HPA活性酶是由50kU亞基和8kU亞基非共價連接而成的異二聚體；有研究［6］證實，HPA前體酶必須經(jīng)過蛋白酶解加工過程才可獲得二聚體活性。

1.3 HPA的生物學(xué)功能及其調(diào)節(jié)

HPA為β葡萄糖苷酸內(nèi)切酶，可以切斷細(xì)胞表面和ECM中乙酰硫酸肝素鹽蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）上的 HS，產(chǎn)生如下生物學(xué)效應(yīng)：1）HSPGs水解，使ECM和GBM穩(wěn)定結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞間質(zhì)屏障功能降低；2）釋放結(jié)合在HS上的bFGF，通過促進(jìn)細(xì)胞分裂、趨化、微血管形成、膠原纖維降解等多方面作用，加快創(chuàng)面愈合及促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，恢復(fù)凋亡細(xì)胞活力；3）釋放結(jié)合在乙酰肝素上的尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）和組織纖溶酶原激活物（tPA），溶解基質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；4）uPA和tPA還可通過活化表皮生長因子（epidermal growth factor，ECF），激活ECM中的蛋白質(zhì)酶聯(lián)反應(yīng)，使膜的功能降低，屏障功能減退；5）誘發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)性超敏反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)；6）激活酯酶增強(qiáng)脂質(zhì)代謝。該酶廣泛存在于細(xì)胞膜和ECM中，并保持穩(wěn)定水平，以調(diào)節(jié)乙酰肝素生成和降解平衡，維持機(jī)體組織細(xì)胞正常的增殖、分化、黏附和遷移。

HPA的活性作用受神經(jīng)生長因子（NGF）、乙酰肝素相關(guān)蛋白和富含組氨酸蛋白肝素類似物的影響。D.Marchetti等［7］在研究黑素瘤的神經(jīng)營養(yǎng)調(diào)節(jié)、侵襲過程的實驗中發(fā)現(xiàn)，NGF和神經(jīng)營養(yǎng)因子23（NT23）能夠提高HPA的活性，因為它們能夠與神經(jīng)營養(yǎng)因子受體p75NTR結(jié)合。然而不能與神經(jīng)營養(yǎng)因子受體p75NTR結(jié)合的NGF突變體和非神經(jīng)生長因子不能提高黑色素瘤細(xì)胞的侵襲力。另外還檢測了在合成的HSPGs存在情況下RL95細(xì)胞HPA的活性，證實乙酰肝素鹽相關(guān)蛋白和HPA對HS特異性識別有共同的機(jī)制，它們依賴HS的活性可能相互調(diào)節(jié)。

2 HPA與蛋白尿性腎小球疾病

腎小球濾過屏障是腎小球的重要結(jié)構(gòu)，由內(nèi)皮細(xì)胞、GBM、足細(xì)胞及其裂孔隔膜三層結(jié)構(gòu)所構(gòu)成，濾過屏障的完整性在阻止蛋白質(zhì)漏出中起關(guān)鍵作用。HSPGs是一類大分子蛋白聚糖類化合物，由核心蛋白、HS側(cè)鏈、葡胺聚糖側(cè)鏈共價相連，是GBM的重要組成成分，HS側(cè)鏈上硫酸根和羧基對GBM陰離子電荷起重要作用。HS一方面富含豐富的負(fù)電荷，可限制帶負(fù)電的血漿白蛋白通過，另一方面可與GBM中的膠原和層粘連蛋白相互作用維持GBM分子結(jié)構(gòu)的完整性。

一般認(rèn)為，HPA是哺乳動物中唯一可以選擇性降解HS側(cè)鏈的糖苷內(nèi)切酶，在脾臟、淋巴結(jié)等免疫組織中均可檢測到，而在其他正常組織中，如腎臟、心臟等不表達(dá)或低表達(dá)。M.J.van den Hoven等［8］報道，HPA在人腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)極少，其中在皮質(zhì)髓質(zhì)的小管上皮細(xì)胞的表達(dá)相對較高。同時V.Levidiotis等［9］近來也報道HPA在正常大鼠腎臟的腎小球不表達(dá)，在小管上皮細(xì)胞呈低表達(dá)。但是病理狀態(tài)下腎臟HPA的表達(dá)增高（主要是腎小球HPA的表達(dá)增加），從側(cè)面證明了機(jī)體內(nèi)正常水平HPA含量對于維持腎小球正常生理功能的重要性。

HPA通過裂解HS側(cè)鏈，破壞HSPGs完整性可導(dǎo)致GBM選擇通透性改變及腎小球上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞錨連位點(diǎn)的喪失。此外，HPA不僅能夠降解HS側(cè)鏈，還使與HS結(jié)合的一系列生長因子釋放出來，產(chǎn)生相應(yīng)的繼發(fā)反應(yīng)可能參與了在各種蛋白尿性腎小球疾?。ㄌ悄虿⌒阅I病［10－11］、動物模型的膜性腎?。?2］、藥物所致腎?。?，13］、抗基底膜抗體疾?。?4］、兒童激素敏感性腎病綜合征［15］、局灶節(jié)段性腎小球硬化性腎病、IgA腎病、微小病變性腎?。?6］、淀粉樣變性?。?7］）的病理生理過程。

但存在爭議的是，最近有一部分研究顯示HPA可能與腎小球性蛋白尿的發(fā)生發(fā)展并不存在明確的關(guān)聯(lián)。T.J.Wijnhoven等［18］研究表明，不論伴有或不伴有蛋白尿的成年人和兒童腎臟病患者的腎臟HS主鏈表達(dá)沒有異常。J.van den Bom等［19］研究表明，尿白蛋白排泄率增加可能與腎小球HS的表達(dá)和結(jié)構(gòu)的改變沒有明確的關(guān)聯(lián)。更有研究［20］提出新的觀點(diǎn)，認(rèn)為HS保持GBM處于一個“開放狀態(tài)”，促進(jìn)蛋白通過腎小球毛細(xì)血管壁。研究人員給小鼠靜脈應(yīng)用神經(jīng)氨酸苷酶（可水解GBM神經(jīng)氨酸）后導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生白蛋白尿，再加用肝素酶Ⅲ后，電鏡下發(fā)現(xiàn)HS消失，同時尿中蛋白減少。

3 HPA與DN的相關(guān)性

我國DN是導(dǎo)致終末期腎病的第二位原因。DN導(dǎo)致蛋白尿形成的機(jī)制有：腎小球內(nèi)毛細(xì)血管跨膜壓力過高；腎小球濾過屏障功能障礙，包括濾孔改變和電荷改變；腎小球上皮細(xì)胞代謝障礙等。近年來，人們對DN分子發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識不斷深入，血流動力學(xué)紊亂/內(nèi)皮細(xì)胞受損固然是DN蛋白尿的始發(fā)因素，但內(nèi)皮細(xì)胞之間的窗孔較大，在正常情況下即能讓白蛋白自由通過，GBM則成為真正防止蛋白質(zhì)漏出的第一道屏障。

近年來有許多的證據(jù)表明，HPA參與了DN的發(fā)生發(fā)展。J.B.Maxhimer等［11］研究表明，在DN的病理狀態(tài)下，可能由于內(nèi)環(huán)境中高水平葡萄糖含量的影響可誘導(dǎo)HPA的表達(dá)增加和基底膜上HS的表達(dá)減少。在體外高糖環(huán)境中培養(yǎng)腎臟上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)HPA mRNA的表達(dá)上調(diào)，HPA抑制劑能夠保護(hù)細(xì)胞表面HS的表達(dá)。又有進(jìn)一步的研究［10，21］觀察到，在臨床蛋白尿和微量白蛋白尿的糖尿病患者中HPA的活性是增加的，相對正常人的尿液中未能檢測到HPA的活性。唐琳等［22］進(jìn)行的研究表明，DN患者腎組織中HPA表達(dá)升高，并且與尿蛋白量呈正相關(guān)，提示HPA可能參與了DN蛋白尿的發(fā)生。

有研究［23］測定證實糖尿病患者血液、尿液中HPA的水平是增高的。DN患者比不并存糖尿病并發(fā)癥者血液、尿液中HPA水平增高更加明顯，DH患者中的血HPA水平的增高，會進(jìn)一步導(dǎo)致整個機(jī)體中HPA水平的升高，從而影響到其他的器官、組織和細(xì)胞。而接受腎移植后的DN患者尿液中HPA的水平降低，說明了HPA可能主要來源于糖尿病相關(guān)的腎功能衰竭。事實上，免疫組織化學(xué)研究分析表明，HPA表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，在正常腎臟的腎小球中不表達(dá)；但是在DN的腎小球和腎小管上皮細(xì)胞其表達(dá)上調(diào)［11］。值得注意的是，在糖尿病腎移植患者，除了糖尿病相關(guān)的藥物，還需要應(yīng)用的免疫抑制藥物可能會影響乙酰肝素酶的分泌。

4 結(jié)語

DN是糖尿病的重要并發(fā)癥，是一種蛋白尿性腎小球疾病，HPA可通過水解腎小球GBM的重要組成成分HSPGs，導(dǎo)致GBM電荷屏障破壞而在蛋白尿的發(fā)生、發(fā)展中起到一定作用。多項研究證明，DN患者機(jī)體中HPA水平的變化參與了DN的病理生理過程。能否通過檢測HPA早期診斷DN，及通過抑制HPA的表達(dá)是否有助于防治DN的發(fā)生發(fā)展有待于進(jìn)一步的研究。

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