曾秀存,許耀照,2,王勤禮,2,李彩霞

(1.河西學院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院,甘肅 張掖734000;2.河西生態(tài)與綠洲農(nóng)業(yè)研究院,甘肅 張掖734000)

洗滌劑是日常生活中的必需品,我國每年生產(chǎn)400萬t洗滌劑用掉60萬～70萬t三聚磷酸鈉,含磷助洗劑對環(huán)境造成很大的影響[1]。合成洗滌劑由于成本低廉、產(chǎn)量高、去污力強而成為目前使用量最大,使用范圍最廣的家用化工產(chǎn)品,其基本成分為表面活性劑和一些助洗劑,其中陰離子表面活性劑在生產(chǎn)中使用最多[2]。隨著人們生活水平的提高,洗滌劑已進入千家萬戶,它可用來洗滌衣物、餐具和水果蔬菜等。然而,人們在使用洗滌劑時,既希望它有良好的洗滌效果,更關(guān)心洗滌劑的毒性問題。有關(guān)研究指出,在洗滌劑用量遠遠低于日常家庭用量的情況下,洗滌劑對魚類有不同程度的影響,且發(fā)現(xiàn)洗滌劑在存放一定時間后其毒性亦沒有發(fā)生明顯下降,這意味著,含有家用洗滌劑的生活污水不經(jīng)任何處理就排放到水體中,可能會對魚類造成一定的影響[3]。不同濃度的洗衣粉均能抑制蠶豆根的生長,降低根尖細胞有絲分裂指數(shù),誘發(fā)細胞產(chǎn)生高頻率的微核且是明顯的時間與劑量效應關(guān)系[4]。環(huán)境誘變細胞的研究有60Co-γ射線[5]、太空環(huán)境誘變[6-7]等,但洗滌劑誘變植物細胞研究較少。蠶豆(Vicia f aba)根尖微核試驗技術(shù)屬于植物遺傳檢測系統(tǒng),微核試驗是利用環(huán)境污染因子誘變細胞染色體畸變產(chǎn)生微核而建立起來的一種技術(shù),也是近年來環(huán)境生物監(jiān)測領域的重要進展之一[8]。豌豆(Pisum sativum)是甘肅省中部半干旱地區(qū)重要的倒茬養(yǎng)地和飼料作物,在旱地農(nóng)業(yè)和旱農(nóng)生產(chǎn)中起著關(guān)鍵樞紐作用[9]。因此,本研究以豌豆為試材,從細胞水平上研究洗滌劑對豌豆根尖細胞有絲分裂指數(shù)、微核率、染色體畸變率等的影響,以揭示洗滌劑對豌豆根尖細胞的損傷機制,以期為研究洗滌劑的毒性效應機制提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試品種為豌豆“蘇箭3號”,由張掖市農(nóng)業(yè)科學院提供。洗滌劑為甘肅市場上銷量最大的一品牌洗滌劑,從超市購買,洗滌劑的主要成分為復合活性劑、APG、食用香精。選擇飽滿、健康、大小均勻的豌豆種子,用70%(V/V)的酒精消毒后,于25℃培養(yǎng)箱中用蒸餾水浸種24 h,然后置于墊有2層濕濾紙的培養(yǎng)皿中,并蓋上濕紗布,在室溫下發(fā)芽,待根尖長為1.0～1.5 cm時,用于毒性試驗。

1.2 試驗設計 選取生長一致的豌豆根尖,分別置入用蒸餾水稀釋至200倍、100倍、10倍、5倍的4個培養(yǎng)皿中,于25℃下暗培養(yǎng),以蒸餾水處理為對照。連續(xù)處理24和48 h。每隔24 h從每一處理隨機取10個根尖,共取2次,剪取根尖,卡諾固定液(無水乙醇∶冰乙酸=3∶1)固定24 h,蒸餾水浸洗3次后,將根尖轉(zhuǎn)入70%的酒精,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。制片時,將固定的根尖用蒸餾水浸洗 3次,1 mol/L HCl,(60±0.5)℃的恒溫水浴中酸解10 min,水洗后切取分生區(qū)細胞約1 mm,用卡寶品紅染色30 min,常規(guī)壓片。并在DMBA450生物數(shù)碼顯微鏡下觀察。每個處理隨機觀察3～5個根尖,每個根尖至少觀測1 000個分生區(qū)細胞,統(tǒng)計根尖細胞的有絲分裂指數(shù)(MI)、微核率千分率(FMN)和染色體畸變率(AF)[10],用奧林帕斯BH-10對微核和發(fā)生染色體畸變的細胞進行顯微攝影。

1.3 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0軟件進行方差分析,用Microsoft Excel 2003軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同稀釋倍數(shù)的洗滌劑溶液對豌豆根尖細胞有絲分裂指數(shù)的影響 當處理時間為24 h時,隨洗滌劑原液稀釋倍數(shù)的降低,豌豆根尖細胞有絲分裂指數(shù)呈下降趨勢(表1),當洗滌劑原液稀釋倍數(shù)≤10倍時,有絲分裂指數(shù)較對照下降46%,與對照相比差異極顯著(P＜0.01),這表明當洗滌劑原液稀釋倍數(shù)低于一定的范圍時,可明顯抑制豌豆根尖細胞的分裂。當處理時間為48 h時,隨洗滌劑原液稀釋倍數(shù)的降低,豌豆根尖細胞有絲分裂指數(shù)較處理24 h明顯降低,當洗滌劑原液稀釋倍數(shù)≤10倍時,有絲分裂指數(shù)較對照下降92%,與對照相比差異極顯著(P＜0.01)。洗滌劑稀釋溶液能降低豌豆根尖細胞有絲分裂指數(shù),抑制細胞有絲分裂,具有劑量和時間效應關(guān)系。

表1 洗滌劑對豌豆根尖細胞有絲分裂指數(shù)的影響

2.2 不同稀釋倍數(shù)的洗滌劑溶液對豌豆根尖細胞微核率的影響 當處理時間為24 h時,隨洗滌劑原液稀釋倍數(shù)的降低,豌豆根尖細胞微核率不斷增加(表2),當稀釋倍數(shù)為10倍時,根尖細胞微核率達到最大為9.82‰,較對照細胞微核率顯著增加761%;當洗滌劑原液稀釋倍數(shù)≤5倍時,根尖細胞微核率急劇降低,達到2.54‰,與對照無明顯差異;當處理時間為48 h時,隨洗滌劑原液稀釋倍數(shù)的降低,豌豆根尖細胞微核率不斷增加,當原液稀釋倍數(shù)為 100倍時,細胞微核率達到最大為12.48‰,較對照細胞微核率顯著增加824%;當洗滌劑原液稀釋倍數(shù)≤5倍時,根尖細胞微核率迅速降低到1.00‰,較對照降低26%,與對照無明顯差異。這說明洗滌劑原液稀釋在高稀釋倍數(shù)(洗滌劑原液稀釋倍數(shù)≥10倍,24 h;洗滌劑原液稀釋倍數(shù)≥100倍,48 h)時能增加根尖細胞微核率,洗滌劑原液稀釋在低稀釋倍數(shù)(洗滌劑原液稀釋倍數(shù)≤5倍,24 h;洗滌劑原液稀釋倍數(shù)≤10倍,48 h)時降低根尖細胞微核率。

表2 洗滌劑對豌豆根尖細胞微核率的影響

鏡檢發(fā)現(xiàn),在洗滌劑原液稀釋不同倍數(shù)溶液處理的細胞中,豌豆根尖細胞有不同分裂時期的微核出現(xiàn)(圖1),也有部分細胞出現(xiàn)雙微核,微核出現(xiàn)以細胞分裂間期居多。

2.3 不同稀釋倍數(shù)的洗滌劑溶液對豌豆根尖細胞染色體畸變率的影響 當處理時間為24 h時,隨洗滌劑原液稀釋倍數(shù)的降低,豌豆根尖細胞染色體畸變率不斷增加,當原液稀釋倍數(shù)10倍時,染色體畸變率達到最大,為2.05%,較對照染色體畸變率顯著增加113%;當洗滌劑原液稀釋倍數(shù)≤5倍時,根尖細胞染色體畸變率降低到1.65%,與對照差異顯著;當處理時間為48 h時,隨洗滌劑原液稀釋倍數(shù)的降低,豌豆根尖細胞染色體畸變率不斷增加,當稀釋倍數(shù)為100倍時,染色體畸變率達到最大,為3.42%,較對照染色體畸變率增加333%;當洗滌劑原液稀釋倍數(shù)≤10倍時,根尖細胞染色體畸變率迅速降低到0.25%,較對照降低68%,與對照差異顯著(表3)。這說明洗滌劑原液稀釋倍數(shù)高(洗滌劑原液稀釋倍數(shù)≥10倍,24 h;洗滌劑原液稀釋倍數(shù)≥100倍,48 h)時能增加根尖細胞染色體細胞的畸變率,而洗滌劑原液稀釋倍數(shù)低(洗滌劑倍數(shù)≤5倍,24 h;洗滌劑倍數(shù)≤10倍,48 h)時能降低根尖細胞染色體畸變率。鏡檢發(fā)現(xiàn),洗滌劑原液稀釋不同倍數(shù)誘發(fā)豌豆根尖細胞染色體畸變主要包括染色體斷片、滯后染色體、染色體橋等(圖2)。

圖1 豌豆根尖細胞不同分裂時期的微核

表3 洗滌劑溶液對豌豆根尖細胞染色體畸變率的影響

圖2 豌豆根尖細胞染色體畸變核

3 討論

洗滌劑與人們的生活息息相關(guān),如今消費者除了關(guān)心產(chǎn)品的去污力和經(jīng)濟性之外,越來越多的消費者開始重視洗滌產(chǎn)品對人體安全性和環(huán)境相容性[1]。本研究表明,隨著洗滌劑原液稀釋倍數(shù)的降低和處理時間的延長,豌豆根尖細胞有絲分裂指數(shù)成明顯的下降趨勢,處理濃度和處理時間雙因子分析具有明顯的劑量-時間效應。這與王虹和鄧麗芳[11]報道的洗手液具有一定的遺傳毒性,并隨著濃度的增大,毒性增加,呈現(xiàn)出劑量-效益關(guān)系結(jié)果相一致。隨著洗滌劑原液稀釋倍數(shù)的降低,細胞分裂指數(shù)下降,稀釋倍數(shù)越小,抑制作用越明顯。

洗滌劑原液在稀釋倍數(shù)低時,可導致豌豆根尖細胞微核率、染色體畸變率明顯增加;洗滌劑原液在稀釋倍數(shù)低時,細胞微核率、染色體畸變率下降,但洗滌劑原液稀釋不同倍數(shù)和處理不同時間,對細胞微核率、染色體畸變率不具有劑量-時間效應關(guān)系,這與張江麗等[3]報道的洗發(fā)水均可誘發(fā)蠶豆根尖細胞產(chǎn)生微核及染色體畸變,并表現(xiàn)為良好的劑量-效應關(guān)系的結(jié)果不一致。其原因一方面可能是洗滌劑在高稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)時,隨著洗滌劑倍數(shù)的降低,洗滌劑對豌豆根尖細胞的遺傳物質(zhì)毒害作用加強,在細胞分裂各個時期均出現(xiàn)微核(圖1),同時微核率也隨之增加,而在低稀釋倍數(shù)時,微核率顯著下降,這由于高濃度的洗滌劑對細胞的損傷加劇,從而導致一些受損的細胞未完成有絲分裂過程,導致微核率下降。另一方面,由于在低稀釋倍數(shù)處理下,豌豆根尖細胞出現(xiàn)了更加嚴重的毒害現(xiàn)象,出現(xiàn)核固縮(圖1、圖2)。核固縮的細胞處于轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài),會影響正常的細胞代謝活動。由于核固縮的細胞不再參與有絲分裂,使根尖中分裂細胞數(shù)目減少,那些不分裂的細胞中的染色體畸變不能表現(xiàn)為間期微核而引起分裂指數(shù)和微核率下降。

鏡檢發(fā)現(xiàn),根尖分裂細胞中有大量的染色體斷片、染色體橋(圖2),說明洗滌劑原液不同稀釋倍數(shù)對碗豆根尖細胞染色體的主要組成物質(zhì)DNA的結(jié)構(gòu)組成可能有一定影響,具有一定遺傳毒性。但對豌豆的其他生物學效應——過氧化氫酶及過氧化物酶活性的影響有待進一步研究和探討。

4 結(jié)論

洗滌劑原液稀釋不同倍數(shù),處理24和48 h后,能明顯降低豌豆根尖細胞有絲分裂指數(shù),抑制細胞有絲分裂,具有明顯的劑量-時間效應關(guān)系。洗滌劑原液在高稀釋倍數(shù)時,處理24和48 h后,能增加根尖細胞的染色體畸變率和微核率;在較低稀釋倍數(shù)范圍內(nèi),處理24和48 h后,能降低根尖細胞染色體畸變率和微核率,稀釋不同倍數(shù)的洗滌劑處理24和48 h后對根尖細胞的染色體畸變率和微核率不具有劑量—時間效應。不同稀釋倍數(shù)的洗滌劑影響豌豆根尖細胞分裂,導致根尖細胞多種畸變類型,對豌豆根尖細胞具有一定的遺傳毒性。

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