陳素雅 蔡華雄

牙髓細(xì)胞的增殖分化以及牙本質(zhì)的修復(fù)與再生是多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果。其中生長(zhǎng)因子在許多重要環(huán)節(jié)起關(guān)鍵性作用。富血小板血漿(Platelet-rich plasma，PRP)是自體血漿中的高濃度的血小板，是一種富含血小板的血液制品，含有高濃度的生長(zhǎng)因子、血小板和纖維素[1]，能促進(jìn)細(xì)胞增殖、基質(zhì)合成和血管生成。有研究證實(shí)，PRP促進(jìn)骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞有增殖作用[2-3]。但PRP作為多種復(fù)合生長(zhǎng)因子,其作用機(jī)制尚不十分明確，目前研究較多的是轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)和血小板來(lái)源生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)相關(guān)抗體的拮抗作用，分別屏蔽PRP中兩種主要生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子和血小板來(lái)源生長(zhǎng)因子的功能，觀察PRP中不同生長(zhǎng)因子在大鼠牙髓細(xì)胞的增殖作用中發(fā)揮的效應(yīng)。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 大鼠TGF-β1 ELISA試劑盒武漢博士德生物工程有限公司

大鼠PDGF-AB ELISA試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司

大鼠TGF-β1抗體 武漢博士德生物工程有限公司

大鼠PDGF-AB抗體 武漢博士德生物工程有限公司

MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司

CCK-8試劑盒 廣州威佳科技有限公司

1.1.2 主要儀器和設(shè)備 Shellab 2323-2 CO2培養(yǎng)箱 SHELLAB

HERAguard HPH12超凈工作臺(tái) THERMO

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，4周齡，性別不限，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠牙髓細(xì)胞的培養(yǎng) 取3-4周齡SD大鼠，性別不限，處死后解剖上下頜骨，超凈工作臺(tái)內(nèi)解剖上下頜切牙，取出牙髓，酶消組織塊法培養(yǎng)牙髓細(xì)胞，按1∶2比例進(jìn)行傳代，檢測(cè)細(xì)胞來(lái)源并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，取第五代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 PRP的制備 采用Landesberg兩步離心法[4]，從大鼠心臟抽取全血2 ml入含有0.2ml10%枸櫞酸鈉抗凝管，第1次200 g/min離心10 min，全血可見(jiàn)分為3層，吸取全部上清液至交界面下約3 mm，200 g/min二次離心10 min，棄掉大部分上清液，剩余液體約0.2 ml，按體積10：1加入含1000 μ/ml牛凝血酶的10%氯化鈣溶液，可見(jiàn)數(shù)秒內(nèi)凝結(jié)成膠凍樣，4℃過(guò)夜后，5000 r/min離心10 min，取上清液，過(guò)濾除菌。將10 μl PRP加入90 μl DMEM中制備成10%PRP培養(yǎng)基，將5 μl PRP加入95 μl DMEM中制備成5%PRP培養(yǎng)基。

1.2.3 PRP中血小板及生長(zhǎng)因子測(cè)定 在全自動(dòng)血常規(guī)分析儀上分別檢測(cè)全血及PRP中血小板數(shù)目；采用ELISA方法分別測(cè)定PRP中TGF-β1、PDGF-AB的水平。

1.2.4 細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用CCK-8法。選擇生長(zhǎng)良好的第5代大鼠牙髓細(xì)胞以濃度3×104個(gè)/ml接種于96孔培養(yǎng)板。每孔100 μl，加入不同刺激物 100 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，每孔加入CCK-8溶液10 μl，37℃繼續(xù)孵育2 h后分光光度計(jì)測(cè)各孔吸光度值。各濃度組取平均值,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每組6孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)1：①對(duì)照組，僅加入DMEM；②10%FBS組(DMEM+10%FBS)；③5%PRP組(5%PRP+DMEM)；④10%PRP 組(10%PRP+DMEM)；

實(shí)驗(yàn)2：①5%PRP組(5%PRP+DMEM)；②TGF-β1抗體組(5%PRP+TGF-β1抗體 20 μg/ml+DMEM)；③PDGF-AB抗體組(5%PRP+PDGF-AB 抗體 20μg/ml+DMEM)；④PDGFAB抗體聯(lián)合TGF-β1抗體組(5%PRP+PDGFAB 抗體 20μg/ml+TGF-β1 抗體 20 μg/ml+DMEM)。

2.結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)狀況 原代培養(yǎng)細(xì)胞約在第4-6天從組織塊邊緣爬出，呈星形或多角形，少量呈梭形或三角形，約10-14天后細(xì)胞匯合。細(xì)胞波形絲蛋白(Vimentin)及角蛋白(CK)免疫組化染色顯示抗Vimentin陽(yáng)性,CK陰性,說(shuō)明細(xì)胞來(lái)源于中胚層,非上皮源性(圖1、2)。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示第5天達(dá)生長(zhǎng)高峰。

2.2 PRP中血小板及生長(zhǎng)因子測(cè)定 經(jīng)過(guò)Landesberg兩步法離心后制備的PRP中血小板含量為1790.58±388.08×109個(gè)/L,是全血中的3.17倍。激活后PRP中TGF-β1的含量為3.080 ng/ml，PDGF-AB的含量為10.706ng/ml。

圖1 Vimentin染色陽(yáng)性(SABC×200)

圖2 CK染色陰性(SABC×200)

2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)

CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果由OD值表現(xiàn)(表1、2)。

表1 不同濃度PRP對(duì)細(xì)胞增殖作用

表2 加入抗體后5%PRP對(duì)細(xì)胞增殖作用

48h時(shí)10%和5%PRP組與DMEM組比較，OD值均有顯著差異，P＜0.05；而且10%和5%PRP組與FBS組比較，OD值均有顯著差異，P＜0.05；10%與5%PRP組之間OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。

5%PRP組與PDGF-AB組和PDGF-AB抗體聯(lián)合TGF-β1抗體組比較，均有顯著性差異(P＜0.05),PDGF-AB組和PDGF-AB抗體聯(lián)合TGF-β1抗體組 OD值均低于 5%PRP組；PDGF-AB抗體聯(lián)合TGF-β1抗體組與TGF-β1抗體組和PDGF-AB抗體組之間，均有明顯差異(P＜0.05)，PDGF-AB組OD值低于PDGF-AB組與 PDGF-AB抗體聯(lián)合 TGF-β1抗體組，TGF-β1抗體組 OD值高于 PDGF-AB組與PDGF-AB抗體聯(lián)合TGF-β1抗體組。

3.討論

PRP是通過(guò)密度梯度離心法從全血中分離提取出來(lái)的，不同的離心次數(shù)、離心時(shí)間和離心力所得的PRP中的血小板的濃度和活性各不相同[5]。由于血小板在體外較脆弱和易于激活，因此過(guò)大的離心力和過(guò)長(zhǎng)的離心時(shí)間都有可能引起血小板膜破裂，血小板破壞[6]，同時(shí)可能使部分血小板沉降至紅細(xì)胞層，導(dǎo)致制備的PRP中血小板活性降低或濃度減少，從而影響PRP的生物學(xué)性能。Marx等的研究認(rèn)為，PRP的最低工作濃度血小板濃度應(yīng)大于1000×109個(gè)/L[7]。Landesberg[4]建議二次離心時(shí)均采取0.20 N的力離心10 min。本實(shí)驗(yàn)采取Landesberg兩步離心法，所得的PRP中血小板濃度與文獻(xiàn)基本一致。

PRP中含有高濃度的血小板，其濃度可以達(dá)到全血中濃度的2.105-3.138倍[4,7]，通過(guò)α顆粒脫顆粒釋放激活的生長(zhǎng)因子啟動(dòng)損傷修復(fù)，α顆粒釋放的蛋白包括[8,9]：血小板來(lái)源生長(zhǎng)因子(PDGF)、 轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子 (TGF)、 骨形成蛋白(BMPs)、類胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和其他刺激增殖、趨向和分化的分子。這些生長(zhǎng)因子通過(guò)吸引新形成基質(zhì)中的未分化細(xì)胞和激發(fā)細(xì)胞分裂促進(jìn)損傷修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同濃度PRP與DMEM和10%FBS培養(yǎng)基對(duì)大鼠牙髓細(xì)胞增殖作用的比較，顯示PRP對(duì)大鼠牙髓細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用，且不需依賴FBS的存在，是由于PRP中含有比FBS更豐富的生長(zhǎng)因子；10%PRP對(duì)大鼠牙髓細(xì)胞的增殖與5%PRP無(wú)明顯差異，表明PRP的刺激增殖作用并非隨著濃度的增高而增強(qiáng)。

TGF和PDGF是目前研究較多的生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和成骨的作用[10]。Yoichiro等[10]的實(shí)驗(yàn)報(bào)道在PRP中用TGF、PDGF和IGF抗體拮抗對(duì)應(yīng)生長(zhǎng)因子的作用發(fā)現(xiàn)，拮抗生長(zhǎng)因子后PRP對(duì)細(xì)胞增殖的作用降低。Shirakama報(bào)道TGF-β1在0.1μg/L和5μg/L時(shí)均可增加人P1系的牙髓細(xì)胞DNA合成[11]。本實(shí)驗(yàn)觀察到PRP中加入TGF-β1抗體后，牙髓細(xì)胞增殖反而略有升高，盡管差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明可能是由于PRP是多種生長(zhǎng)因子的復(fù)合體，各種生長(zhǎng)因子間存在相互補(bǔ)充或相互抑制或拮抗的作用，在屏蔽某種生長(zhǎng)因子后，PRP中的其它生長(zhǎng)因子能替代其起促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)。

PDGF有趨化成纖維細(xì)胞，促進(jìn)膠原和蛋白合成的作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)，正常情況下，在牙髓成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞薄膜上均有PDGF受體β亞基表達(dá)[13]，PDGF可以誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的DNA合成和細(xì)胞增殖,在正常牙髓組織中牙髓細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PDGF-β受體,提示PDGF在牙髓組織的生長(zhǎng)、發(fā)育等正常生理過(guò)程和創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中起著重要的作用[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，加入PDGF-AB抗體后可以使細(xì)胞增殖明顯降低，說(shuō)明PDGF-AB被拮抗后PRP的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用明顯減弱，從而證明PDGF-AB能顯著刺激大鼠牙髓細(xì)胞增殖，在PRP中起重要作用，這與Yoichiro等[10]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。在同時(shí)加入TGF-β和PDGF-AB抗體后，雖然降低了PRP對(duì)大鼠牙髓細(xì)胞的增殖作用，但變化幅度比僅加入PDGF-AB抗體明顯縮小，推測(cè)原因可能是由于PRP是多種生長(zhǎng)因子和蛋白的復(fù)合物，在對(duì)細(xì)胞發(fā)揮作用時(shí)存在復(fù)雜的相互作用，不同的生長(zhǎng)因子間存在相互抑制或調(diào)節(jié)的作用。

雖然PRP已經(jīng)廣泛應(yīng)用并在臨床應(yīng)用顯示積極的效果[15]，但由于各種研究報(bào)告方法各異，結(jié)果也不相同[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，PRP能顯著刺激牙髓細(xì)胞的增殖，其中PDGF-AB在PRP中促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要的作用，PRP中的各種生長(zhǎng)因子之間可能存在著相互調(diào)控、拮抗的作用。關(guān)于PRP對(duì)大鼠牙髓細(xì)胞分化的影響，本實(shí)驗(yàn)將做進(jìn)一步觀察。牙髓細(xì)胞的增殖和分化是牙髓組織修復(fù)和再生的基礎(chǔ)，因此，探索及研究以闡明PRP及其主要生長(zhǎng)因子對(duì)牙髓組織修復(fù)再生的機(jī)制將為PRP應(yīng)用于活髓保存治療提供理論基礎(chǔ)。

[1]Mehta S,Watson JT.Platelet rich concentrate：basic science and current clinical applications[J].J Orthop Trauma,2008,22(6)：432-438

[2]Choi BH,Zhu SJ,Kim BY,et a1.Effect of platelet-rich plasma(PRP)concentration on the viability and proliferation of alveolar bone cells：an in vitro study[J].J Oral Maxillofac Surg,2005,34(4)：420-424

[3]Graziani F， Ceis， Ducci F， et a1.In vitro effects of deferent concentration of PRP on primary bo ne an d gingival cell lines preliminary results[J].Minerva Stomatol，2005，54(1-2)：15-22

[4]Landesberg R,Roy M,Glickman RS.Quantification of growth factor levels using a simplified method of platelet-rich plasma gel preparation[J].J Oral Maxillofac Surg,2000,58(3)：297-300

[5]Qiu J,Zhang C,Yuan T,et al.Application and effect of platelet-rich plasma and its relevant factors for tissue repair and regeneration[J].Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research,2009,13(41)：8131-8134

[6]Gonshor A.Technique for producing platelet-rich plasma and platelet concentrate：background and process[J].Int J Periodontics Restorative Dent,2002,22(6)：547-557

[7]Marx RE.Platelet-rich plasma(PRP)：What is PRP and what is not PRP?J Implant Dent,2001,10(4)：225-228

[8]Everts PA,BrownMahoney C,Hoffmann JJ,et al.Plat elet-rich plasma preparation using three devices：implic ations for platelet activation and platelet growth factor release[J].J Growth Factors,2006,24(3)：165-171

[9]Eppley BL,Woodell JE,Higgins J.Platelet quantification and growth factoranalysis from platelet-rich plasma：implications for wound healing[J].Plast Reconstr Surg,2004,114(6)：1502-1508

[10]Yoichiro Ogino,Yasunori Ayukawa,Toshio Kukita,et al.The contribution of platelet-derived growth factor,transforming growth factor-b1,and insulin-like growth factor-I in platelet-rich plasma to the proliferation of osteoblast-like cells[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,2006,101(6)：724-729

[11]Shirakawa M,Shiba H,Nakanishi K,et al.Transforming growth factor-β1 reduces ALK aline phosphatase mRNA and activity and stimulates cell proliferation in cultures of human pulp cell[J].Dent Res,1994,73(9)：1509-1514

[12]Matsuda N,Lin WL,Kumar NM,et al.Mitogenic,chemotactic,and synthetic responses of rat periodontal ligament fibroblastic cells to polypeptide growth factors in vitro[J].J Periodontol,1992,63(6)：515-525

[13]Chen Q,Shi J,Jin Y,et al.An immunohistochemical study on the expression of receptor of platelet-derived growth factor in human pulp[J].Chinese Journal of Conservative Dentistry,2004,14(2)：72-74

[14]Hoppenreijs VP,Pels E,Vrensen GF,et al.Platelet derived growth factor：receptor expression in corneas and effects on corneal cells[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1993,34(3)：637-649

[15]Oyama T,Nishimoto S,Tsugawa T,et al.Efficacy of platelet-rich plasma in alveolar bone grafting[J].J Oral Maxillofac Surg,2004,62(5)：555-558

[16]Jakse N,Tangl S,Gilli R,et al.Influence of PRP on autogenous sinus grafts.An experimental study on sheep[J].Clin Oral Implants Res,2003,14(5)：578-583