徐 波，梁碧玲，鄧宇斌*

細(xì)胞移植(cell transplantation)是將自體細(xì)胞或異體細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增或分化培養(yǎng)后再移植入動物體特定部位的技術(shù)，主要應(yīng)用于細(xì)胞治療和科學(xué)研究中。隨著干細(xì)胞研究的不斷深入，移植干細(xì)胞通過分泌相關(guān)營養(yǎng)因子或定向分化更新病損組織的方式對特定疾病進(jìn)行治療已成為近幾年的研究熱點(diǎn)[1]。將細(xì)胞移植入體內(nèi)后，研究者需要一種有效的手段監(jiān)測移植細(xì)胞在遷移、分布、功能分化等，為評價(jià)治療效果和研究作用機(jī)制提供依據(jù)。當(dāng)細(xì)胞移植應(yīng)用于臨床治療時(shí)，要求這種監(jiān)測方法不能對患者造成二次損傷。磁共振成像技術(shù) (magnetic resonance imaging,MRI)是利用人體組織中某種原子核的核磁共振現(xiàn)象，使用計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)，將人體不同類型及不同生理狀態(tài)的組織進(jìn)行成像的診斷技術(shù)，具有無輻射損傷、非侵入性、高敏感性、高分辨率并能對監(jiān)測對象三維重構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，非常適合用于活體監(jiān)測移植細(xì)胞[2]。MRI對比劑(contrast agents)，可使局部磁共振信號發(fā)生明顯變化。使用MRI對比劑對體外培養(yǎng)的細(xì)胞標(biāo)記后進(jìn)行細(xì)胞移植，可使用MRI對移植細(xì)胞實(shí)現(xiàn)連續(xù)多時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測。隨著磁共振細(xì)胞標(biāo)記及細(xì)胞成像研究的發(fā)展，大量的相關(guān)研究成果被陸續(xù)報(bào)道，本文就目前研究最活躍的細(xì)胞標(biāo)記用磁共振對比劑和相應(yīng)的標(biāo)記方法作一綜述。

對細(xì)胞進(jìn)行磁共振對比劑標(biāo)記，一方面對比劑的本身的特性決定了標(biāo)記的效果，為了提高標(biāo)記率，對比劑的分子量、電荷性及溶解性有嚴(yán)格限制。一般而言，分子量越小越則容易進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。由于細(xì)胞膜表面帶有微弱的負(fù)電荷，所以如果對比劑本身帶有正電荷，則更容易吸附于細(xì)胞膜，有利于細(xì)胞標(biāo)記。但如果對比劑表面帶有負(fù)電荷則會受到細(xì)胞表面負(fù)電荷的排斥，可以利于多種陽離子轉(zhuǎn)染試劑輔助進(jìn)行標(biāo)記。另一方面細(xì)胞自身的特性決定了標(biāo)記難度，用于細(xì)胞移植的細(xì)胞主要有兩類，即免疫細(xì)胞和干細(xì)胞。相比之下一部分免疫細(xì)胞具有較強(qiáng)的吞噬能力，可以直接通過胞吞或胞飲的方式將對比劑吞入胞內(nèi)完成標(biāo)記，而干細(xì)胞則較難進(jìn)行標(biāo)記，通常需要使用輔助方法進(jìn)行有效標(biāo)記。

1 細(xì)胞標(biāo)記對比劑

1.1 順磁性對比劑

這一類對比劑大多為鑭系元素螯合物，其中以釓螯合物居多，包括Gd-DTPA、Gd-DTPA-BMA、Gd-HP-DO3A等。Gd-DTPA于1987年即被美國FDA批準(zhǔn)為第一種用于臨床診斷的磁共振對比劑。此類對比劑可在一定濃度范圍內(nèi)使標(biāo)記細(xì)胞在T1加權(quán)成像時(shí)造呈高信號[3]。較早的研究工作，以研究對比劑性能為主，2004年Crich等[4]分別用Gd-HP-DO3A 和Eu-HP-DO3A標(biāo)記內(nèi)皮祖細(xì)胞，銪(Eu)為鑭系元素，標(biāo)記過程未使用其他輔助標(biāo)記試劑。標(biāo)記細(xì)胞中Gd濃度達(dá)到0.1 μmol/mg蛋白質(zhì)。但將標(biāo)記細(xì)胞移植入小鼠腎臟后，僅有Gd-HP-DO3A標(biāo)記的細(xì)胞可以在MRI T1 WI呈高信號，信號增強(qiáng)效果可維持14天以上。同時(shí)發(fā)現(xiàn)標(biāo)記后的內(nèi)皮祖細(xì)胞具有良好的細(xì)胞活性，并保持有血管新生能力。研究者發(fā)現(xiàn)，某些細(xì)胞由于細(xì)胞類型的原因，很難使用順磁性對比劑直接標(biāo)記，需要通過輔助標(biāo)記方法進(jìn)行有效標(biāo)記，2006年Terreno等[5]應(yīng)用電穿孔法和直接孵育標(biāo)記法分別將Gd-HP-DO3A標(biāo)記入大鼠肝癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中和內(nèi)囊泡中，發(fā)現(xiàn)等量的Gd-HP-DO3A進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)比進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)囊泡能在MRI下造成更強(qiáng)的信號變化。隨著干細(xì)胞研究的發(fā)展，磁共振干細(xì)胞成像逐漸成為研究熱點(diǎn)，2008年本課題組鄧宇斌等，使用jet-PEI輔助Gd-DTPA成功標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，通過細(xì)胞毒性測試等評價(jià)了標(biāo)記過程的生物安全性，結(jié)果顯示標(biāo)記過程對細(xì)胞的生理狀態(tài)沒有明顯影響，將標(biāo)記細(xì)胞移植入大鼠脊髓損傷模型中，標(biāo)記細(xì)胞在MRI T1WI呈高信號，可通過MRI對標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行示蹤研究[6]。

1.2 超順磁性對比劑

超順磁性對比劑主要為一類氧化鐵納米顆粒，直徑在20～150 nm之間。根據(jù)他們的粒徑可將其分為小型超順磁性氧化鐵顆粒(SPIOs)和超小型超順磁性氧化鐵顆粒(USPIOs)[7]，通常粒徑小于50 nm則被稱為USPIOs。此類對比劑通過使組織的T2弛豫時(shí)間明顯縮短，在T2WI上顯示為低或無信號，在體內(nèi)與周圍組織形成對比成像，并且敏感性高于順磁性對比劑，在更低的標(biāo)記濃度下就可以造成足夠的信號對比[8]。SPIOs自1996年即被美國FDA批準(zhǔn)為第一種用于臨床診斷的此類磁共振對比劑。由于SPIO和USPIO表面帶有負(fù)電荷，與細(xì)胞膜表面負(fù)電荷具有一定的排斥作用，難以通過直接胞吞的形式進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記。通常使用帶正電荷的轉(zhuǎn)染試劑輔助進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記，可有效提高標(biāo)記效果，并降低標(biāo)記過程的細(xì)胞毒性[9-13]。王建東等構(gòu)建鐵蛋白高表達(dá)細(xì)胞株，并使用SPIO標(biāo)記細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)鐵蛋白可以提高標(biāo)記效果，這可能是由于鐵蛋白可促進(jìn)細(xì)胞攝取和儲存鐵原子；細(xì)胞移植后體內(nèi)MRI結(jié)果表明高表達(dá)鐵蛋白可延長SPIO活體示蹤細(xì)胞的時(shí)間，這可能是鐵蛋白將細(xì)胞內(nèi)降解的SPIO鐵原子作為額外鐵源進(jìn)行攝取，從而增強(qiáng)磁共振信號[12]。目前，超順磁對比劑干細(xì)胞標(biāo)記已有大量研究，Gonzalez-Lara等于2010年了使用MPIOs標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)原位移植入大鼠脊髓損傷模型損傷位點(diǎn)，并對移植細(xì)胞完成了長達(dá)6周的MRI追蹤，標(biāo)記效果持續(xù)時(shí)間較理想[7]。本課題組也進(jìn)行了類似實(shí)驗(yàn)，但發(fā)現(xiàn)由于很多損傷會造成機(jī)體局部出血和水腫，而出血和水腫會在T2 WI下呈低信號，超順磁標(biāo)記細(xì)胞在T2 WI下也呈低信號，兩者具有明顯的信號干擾，因此超順磁性標(biāo)記物在某些損傷出血動物模型的應(yīng)用不佳[6]。

1.3 氟磁共振對比劑

氟對比劑主要應(yīng)用于19F磁共振，由于19F磁共振不同于1H磁共振，其掃描成像的對象是氟原子而不是氫原子。由于動物內(nèi)不存在內(nèi)源性的氟，因此19F磁共振僅能對氟對比劑標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行成像，特異性更強(qiáng)，但由于動物體其他組織在19F磁共振下沒有信號，也就沒有任何背景，所以無法定位，需要配合1H磁共振影像重疊進(jìn)行定位[14]。2005年，Ahrens等使用全氟聚醚(PFPE)及轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine標(biāo)記大鼠樹突細(xì)胞，定量核磁共振分析表明單獨(dú)使用PFPE進(jìn)行標(biāo)記組，標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)PFPE濃度達(dá)到0.25 ng/cell。但隨著細(xì)胞增殖，標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的PFPE隨時(shí)間逐漸降低，體外培養(yǎng)5天后，胞內(nèi)PFPE濃度減少85%。研究者將PFPE標(biāo)記的細(xì)胞移植入大鼠體內(nèi)，使用19F磁共振和1H磁共振分別成像后疊加圖像，實(shí)現(xiàn)了對標(biāo)記細(xì)胞的定位示蹤并觀察到移植細(xì)胞在體內(nèi)遷移情況[15]。

2 標(biāo)記方法分類

2.1 直接胞吞或胞飲的方式

胞吞或胞飲的方式主要用于標(biāo)記免疫細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞等。這類細(xì)胞具有很強(qiáng)的吞噬能力，可以通過吞噬作用直接將對比劑顆粒吞入細(xì)胞質(zhì)中，并不需要其他輔助標(biāo)記方法。Rausch和Saleh 等分別使用USPIOs成功標(biāo)記巨噬細(xì)胞，在腦梗大鼠模型中使用MRI監(jiān)測到標(biāo)記后的巨噬細(xì)胞[16,17]。de Vries等在人體上使用SPIOs標(biāo)記樹突細(xì)胞，在MRI下檢測到標(biāo)記細(xì)胞的遷移和分布，并證明了SPIOs標(biāo)記的安全性[18]。另外Himmelreich等使用可被脂肪酶部分分解的可激活對比劑Gd-DTPA-FA標(biāo)記樹突前體細(xì)胞，標(biāo)記完成后該對比劑處在失活狀態(tài)，只有當(dāng)樹突細(xì)胞分化成熟并分泌脂肪酶后這種對比劑才能被激活進(jìn)而引起磁共振信號變化，因此實(shí)現(xiàn)了通過磁共振監(jiān)測細(xì)胞功能狀態(tài)的目的。但是，Gd-DTPAFA顆粒較大，目前僅適合標(biāo)記樹突細(xì)胞[19]。

雖然干細(xì)胞普遍不具有吞噬能力，但也有研究證實(shí)可通過直接胞吞的方式對干細(xì)胞進(jìn)行磁共振對比劑標(biāo)記。Jendelová等用含有SPIOs的培養(yǎng)基孵育小鼠胚胎干細(xì)胞，并未采用其他輔助標(biāo)記方法，普魯士藍(lán)染色和電子顯微鏡鏡檢證實(shí)SPIOs成功標(biāo)記入干細(xì)胞，后移植入大鼠腦中，MRI檢測到移植細(xì)胞的遷移和分布，標(biāo)記效果可維持50天[20]。

內(nèi)源性免疫細(xì)胞同樣具有很強(qiáng)的吞噬能力，使得內(nèi)源性免疫細(xì)胞可以吞噬組織間隙中的對比劑，這些組織間隙中的對比劑可以是通過靜脈注射的對比劑，也可以是標(biāo)記細(xì)胞移植入體內(nèi)后隨著分裂、死亡等生理過程釋放到組織間隙中的對比劑。當(dāng)內(nèi)源性的免疫細(xì)胞吞噬這些對比劑后，可能在MRI上產(chǎn)生假陽性，使研究者無法正確分辨移植細(xì)胞和內(nèi)源性免疫細(xì)胞[3,21]。

2.2 轉(zhuǎn)染試劑輔助標(biāo)記

許多干細(xì)胞無法通過用單獨(dú)含對比劑的培養(yǎng)基簡單孵育的方式進(jìn)行標(biāo)記。針對這點(diǎn)，目前許多研究者使用轉(zhuǎn)染試劑輔助進(jìn)行磁性標(biāo)記，使用較多的轉(zhuǎn)染試劑主要分為兩類。一類為陽離子物質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑，如多聚左旋賴氨酸(PLL) 、硫酸魚精蛋白等；另一類為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。其工作原理都是依靠吸附作用使轉(zhuǎn)染試劑與對比劑結(jié)合后，共同進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)。陽離子物質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑主要依靠刺激細(xì)胞膜促進(jìn)胞吞，而脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑則主要依靠與胞膜融合將包裹的對比劑遞送入細(xì)胞內(nèi)。

SPIOs表面帶有負(fù)電荷，無法有效吸附到細(xì)胞膜上，Arbab等使用魚精蛋白在體外將SPIOs的標(biāo)記入人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和CD34+造血干細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)MRI監(jiān)測，標(biāo)記效果在CD34+造血干細(xì)胞中達(dá)到2.01±0.1 pg/細(xì)胞，在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中達(dá)到10.94±1.86 pg/細(xì)胞，并證實(shí)這種標(biāo)記方法不會引起明顯的細(xì)胞毒性，標(biāo)記細(xì)胞的增殖和分化能力沒有明顯改變[22]。van den Bos等分別單獨(dú)使用SPIOs或使用脂質(zhì)體輔助SPIO對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)為了達(dá)到相同的有效標(biāo)記濃度，不使用轉(zhuǎn)染試劑標(biāo)記組所需的SIPOs濃度是使用轉(zhuǎn)染試劑標(biāo)記組的100倍，且由于SPIOs濃度過高引起細(xì)胞內(nèi)的自由基生成增加，對細(xì)胞產(chǎn)生明顯毒副作用[23]。

2.3 受體介導(dǎo)的胞吞方式

采用受體介導(dǎo)的胞吞方式進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記，需要對對比劑進(jìn)行局部修飾，針對目的細(xì)胞的特異受體，在對比劑上連接可與這些受體特異結(jié)合的基團(tuán)，以達(dá)到提高轉(zhuǎn)染效率的目的。目前主要選用的多為干細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，在對比劑上共價(jià)結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白后與細(xì)胞進(jìn)行孵育進(jìn)行轉(zhuǎn)染。1998年，Moore等首次構(gòu)建了含有轉(zhuǎn)鐵蛋白基團(tuán)的氧化鐵顆粒后，用這種特異對比劑標(biāo)記干細(xì)胞，其轉(zhuǎn)鐵蛋白基團(tuán)會和干細(xì)胞細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性結(jié)合，引起局部細(xì)胞膜內(nèi)陷，進(jìn)而形成內(nèi)飲泡，將受體-轉(zhuǎn)鐵蛋白-氧化鐵顆粒轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)，受體與轉(zhuǎn)鐵蛋白-氧化鐵顆粒分離后，返回細(xì)胞膜，而將轉(zhuǎn)鐵蛋白-氧化鐵顆粒則留在細(xì)胞內(nèi)，可供MRI檢測[24]。任靜等構(gòu)建前列腺干細(xì)胞抗原(PSCA)特異性MR分子探針7F5@GoldMag用于體外前列腺癌細(xì)胞MR成像，實(shí)現(xiàn)了對前列腺細(xì)胞的高效特異性標(biāo)記，而對照組中使用7F5@GoldMag標(biāo)記物對肝癌細(xì)胞無法進(jìn)行有效標(biāo)記[25]。

2.4 電穿孔等物理方法

電穿孔是功能強(qiáng)大轉(zhuǎn)染技術(shù)，可將核酸、蛋白及其他分子導(dǎo)入多種細(xì)胞。通過高強(qiáng)度的電場作用，瞬時(shí)提高細(xì)胞膜的通透性，從而吸收周圍介質(zhì)中的外源分子。這種技術(shù)可以將核苷酸、DNA 與RNA、蛋白、糖類、染料及病毒顆粒等導(dǎo)入原核和真核細(xì)胞內(nèi)。Geninatti等使用電穿孔方法將質(zhì)粒DNA和Gd-DOTA-spd共同轉(zhuǎn)入干細(xì)胞內(nèi)，通過免疫組化和MRI共同證實(shí)了此方法對干細(xì)胞標(biāo)記的有效性[26]。Walczak等使用130 V和17 ms的電脈沖條件將菲立磁顆粒轉(zhuǎn)染入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞，并證實(shí)電穿孔標(biāo)記法對干細(xì)胞分化能力沒有明顯影響[27]。Terreno等[5]，應(yīng)用電穿孔方法將Gd-HPDO3A標(biāo)記入大鼠肝癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并采用直接孵育法將Gd-HP-DO3A標(biāo)記入大鼠肝癌細(xì)胞的內(nèi)囊泡中，發(fā)現(xiàn)等量的Gd-HP-DO3A進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)比進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)囊泡能在MRI下造成更強(qiáng)的信號變化，其認(rèn)為對比劑在細(xì)胞內(nèi)分布的均勻程度影響MRI信號變化的幅度。

3 展望

MRI監(jiān)測移植細(xì)胞要求細(xì)胞內(nèi)對比劑濃度達(dá)到一定劑量，為了提高被標(biāo)記細(xì)胞中磁共振對比劑的濃度，最簡單的辦法就是在標(biāo)記的過程中增大對比劑的用量或者延長標(biāo)記時(shí)間，但是這都將造成較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，降低細(xì)胞的活力、增殖力以及分化能力，直接影響到細(xì)胞移植后的治療效果。而且，某些情況下提高對比劑濃度并不一定能有效提高標(biāo)記效果。較早的研究已經(jīng)總結(jié)出了各類常用對比劑在不引起明顯細(xì)胞毒性的范圍內(nèi)所能使用的最高劑量和最長標(biāo)記時(shí)間。隨后研究者將目光集中于開發(fā)新型對比劑和輔助標(biāo)記方法，如輔助轉(zhuǎn)染試劑、對比劑表面靶向修飾等，通過這些方法，研究者已經(jīng)可以對多種較難標(biāo)記的細(xì)胞實(shí)現(xiàn)在低毒甚至無毒的條件下完成標(biāo)記。通過以上努力，研究者實(shí)現(xiàn)了通過MRI監(jiān)測移植細(xì)胞的遷移與分布的目的。但隨著移植細(xì)胞的凋亡、增殖或其他生理活動，細(xì)胞中的部分對比劑會釋放到組織間隙或其他內(nèi)源性細(xì)胞中引起假陽性，這一問題仍待解決。事實(shí)上，目前更多的研究集中于監(jiān)測移植細(xì)胞在體內(nèi)功能狀態(tài)的變化，本文作者所在課題組現(xiàn)在也在進(jìn)行此類研究。此類研究主要以兩種策略為主，既基因表達(dá)報(bào)告標(biāo)記物策略和酶解激活報(bào)告標(biāo)記物策略。細(xì)胞功能狀態(tài)的改變實(shí)際上是由某些特定基因表達(dá)的變化引起的，針對這些基因及其下游表達(dá)產(chǎn)物設(shè)計(jì)可調(diào)控對比劑，就可以實(shí)現(xiàn)依靠特定基因的表達(dá)控制對比劑的活性，只有特定基因表達(dá)后對比劑才被激活，才能引起MRI信號變化，從而實(shí)現(xiàn)通過MRI監(jiān)測細(xì)胞功能狀態(tài)的目的。本課題組正在進(jìn)行新型基因表達(dá)報(bào)告標(biāo)記物的研究工作，預(yù)期通過MRI監(jiān)測移植干細(xì)胞在體內(nèi)定向分化的過程。

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