張 強， 王 巖， 李克斌， 尹 姣， 曹雅忠＊， 劉春琴

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學，長春 130118； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193； 3.滄州市農(nóng)林科學院，滄州 061001）

暗黑鰓金龜幼蟲取食Bt后中腸細胞形態(tài)變化的初步研究

張 強1，2， 王 巖1＊， 李克斌2， 尹 姣2， 曹雅忠2＊， 劉春琴3

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學，長春 130118； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193； 3.滄州市農(nóng)林科學院，滄州 061001）

本研究利用透射電鏡技術(shù)觀察了暗黑鰓金龜幼蟲取食Bt后不同時間其中腸細胞形態(tài)變化過程。結(jié)果表明：幼蟲取食Bt后1～7d中腸不同的組織結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生變化，第1天就出現(xiàn)了細胞膜溶解的現(xiàn)象，在第7天細胞膜完全溶解消失；其他器官出現(xiàn)如細胞核核膜溶解，細胞核消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)消失等現(xiàn)象。經(jīng)過中腸細胞一系列的病變，最終導致幼蟲死亡。

暗黑鰓金龜； 蠐螬； Bt； 中腸細胞； 透射電鏡

地下害蟲種類多、分布廣、食性雜、為害嚴重［1］。因為地下害蟲在土中棲息，隱蔽為害，生活世代長，發(fā)生規(guī)律復雜，是國內(nèi)外公認的難以測報和防治的重大害蟲。長期以來，我國對地下害蟲的控制主要依賴化學農(nóng)藥，因而造成農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境污染問題日趨嚴重［2］。而在地下害蟲中又以蠐螬種類多、危害更為突出，蠐螬危害占到地下害蟲危害總量的80%，其中暗黑鰓金龜（Holotrichia parallelaMotschulsky）是常見的優(yōu)勢種之一，其發(fā)生危害日趨嚴重［3－4］。

生物農(nóng)藥由于其高效性、不污染環(huán)境、無殘留等特點，在實際應(yīng)用中受重視程度越來越高。在生物殺蟲劑方面，以蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）的殺蟲效果最為顯著，由于其殺蟲譜廣、藥效期長［5］、對環(huán)境沒有影響，成為生物殺蟲劑中的首選［6－8］。Bt產(chǎn)生于土壤中，能在土壤中自然繁殖，所以是防治地下害蟲的理想藥劑之一。Ohba等在世界上首次從Bt菌株中篩選出對金龜子幼蟲具有高效殺蟲活性的新Bt菌株［9］。近年來國際上對Bt的研究取得了很大的進展，明確了其基本的殺蟲機理：Bt產(chǎn)生的伴胞晶體進入敏感昆蟲中腸，被中腸的堿性蛋白酶水解激活，釋放出抗水解作用的毒素核心片段，特異性地識別并結(jié)合到昆蟲中腸上皮細胞膜的受體上，結(jié)合后毒素的構(gòu)象發(fā)生變化，使毒素能進入細胞膜，之后在細胞膜上形成孔道，破壞了細胞的選擇通透性，最終使中腸上皮細胞脹裂，引起蟲體死亡［10－12］。

目前國內(nèi)外關(guān)于Bt防治暗黑鰓金龜幼蟲的高效菌株鮮見報道，作用機理也不甚明確，而且研究方向主要集中在分子生物學方面，缺乏解剖學和組織學直觀上的描述。本研究利用透射電鏡技術(shù)，從供試蟲體取食Bt后中腸細胞病變過程的解剖學和組織病理學的角度，直接觀察和描述蟲體的死亡原因，為Bt殺蟲作用機理的研究提供圖像依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試昆蟲：田間捕捉暗黑鰓金龜成蟲，在室內(nèi)用榆樹葉飼養(yǎng)至產(chǎn)卵，將卵撿出放入塑料盒內(nèi)孵化，孵化出來的幼蟲用馬鈴薯飼養(yǎng)至3齡初期，待用。

供試Bt菌株：將QC11菌株由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所生物技術(shù)組提供的菌體在固體LB平板上畫線，30℃培養(yǎng)至芽胞釋放，刮去晶胞混合物，用1倍的無菌水懸浮，制成晶胞懸液，待用。

1.2 試驗方法

取3mL晶胞懸液加47mL水制成菌懸液，取曬干的土豆絲10g放入其中，浸泡10min。稱土300g，將浸泡的土豆絲和菌懸液一起倒入其中，靜置泡土20min。將泡好的土豆絲均勻放入已裝有供試蠐螬（60頭）（暗黑鰓金龜幼蟲，下同）的6孔板中，然后將土拌勻，平分到6孔板中，蓋好盒蓋，放置在28℃的環(huán)境中飼養(yǎng)。在處理后的第1、3、5、7、14天各取10頭供試蟲，觀察記錄活躍程度、形態(tài)變化、取食量變化和死亡蟲數(shù)等。解剖前4次取樣蟲體，在解剖過程中目測蟲體的表皮變化、脂肪體變化以及中腸變化，用尖嘴鑷子觸碰，感受其變化程度，并進行相應(yīng)的描述記錄。同時提取中腸，放入固定液中24h后，透射電鏡觀察細胞結(jié)構(gòu)的變化，并拍攝相應(yīng)照片記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼蟲取食Bt菌株QC11后的死亡情況

隨著幼蟲取食帶Bt QC11飼料的時間延長，其死亡率也明顯增加（圖1），即Bt對暗黑鰓金龜幼蟲殺蟲效果是一個緩慢、持續(xù)的過程，這是和化學殺蟲劑最大的區(qū)別。

圖1 暗黑鰓金龜幼蟲取食Bt后的死亡率

2.2 幼蟲取食Bt后亞致死蟲體的病變過程

取食Bt后，幼蟲的活躍度隨著時間的延長明顯降低，但依然有取食的痕跡。蟲體表皮的顏色也由初期的乳白色變?yōu)橄烖S色，失去光澤（暗黑鰓金龜幼蟲在3齡末期表皮呈蠟黃色，但有光澤，與Bt處理過的有明顯不同）。表皮變軟，失去彈性。

對比空白對照組蟲體，亞致死蟲體的中腸明顯變得脆弱，失去彈性，圍食膜部分破損，取食的食物有的和中腸粘連在一起，形成類似于結(jié)石狀的物體。

對照蟲體中腸細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)密集，排列有序（圖2a）；而處理后達到亞致死狀態(tài)的幼蟲中腸細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)疏松，部分出現(xiàn)溶解、斷裂（圖2b）。在死亡蟲體的中腸中很難找到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（圖2c），說明蠐螬被Bt致死后中腸細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)已經(jīng)幾乎完全溶解。

圖2 暗黑鰓金龜死亡幼蟲、亞致死幼蟲與對照幼蟲中腸細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)比較

在亞致死階段蟲體的脂肪體結(jié)構(gòu)變得松散，部分從表皮脫離，附著于中腸上，與中腸發(fā)生粘連。

2.3 幼蟲取食Bt致死蟲體的病變過程

暗黑鰓金龜幼蟲取食Bt致死后體色發(fā)黑，蟲體軟化，完全失去彈性和光澤。

致死蟲體的中腸比亞致死蟲體的中腸變得更易破碎，而且由于圍食膜的完全損壞，取食的食物完全和中腸粘連混雜在一起，形成一塊塊類似結(jié)石狀的物體，中腸變黑，整個腸體完全失去了正常的生理功能。

與對照相對比，在處理后1、3、5、7d4次取樣中處理幼蟲中腸的細胞膜發(fā)生了明顯的變化。處理后1d，中腸細胞膜厚度變薄，細胞核和其他的細胞器無明顯變化（圖3a）；2d后細胞膜出現(xiàn)溶解狀，核膜開始溶解消失（圖3b）；3d后細胞膜基本溶解，核膜消失，細胞核開始溶解，其他細胞器也開始溶解（圖3c）；4d后細胞膜完全溶解，細胞破裂，細胞核消失，其他細胞器溶解，變得模糊（圖3d）；而對照中可以清晰地看到細胞膜、細胞核等細胞器（圖3e）。

圖3 Bt處理后暗黑鰓金龜幼蟲中腸細胞膜的變化

在對照蟲體的中腸內(nèi)可以清晰地看到柱狀細胞，排列密集（圖4a）。而幼蟲取食Bt 1d后，其中腸柱狀細胞基本上全部松散脫落，且形狀變化明顯，有的已經(jīng)開始溶解消失（圖4b）。取食3d后柱狀細胞全部溶解，變得模糊不清（圖4c）。

致死蟲體中的脂肪體變化更為明顯，大部分脂肪體從表皮脫落，部分與中腸發(fā)生粘連，其他溶解，呈流體狀。

圖4 Bt處理后暗黑鰓金龜幼蟲中腸柱狀細胞變化

3 討論

本研究使用的Bt菌株QC11，是國際上第1株針對暗黑鰓金龜幼蟲有毒殺作用的菌株，經(jīng)過生測試驗，其殺蟲效果顯著，尤其是針對暗黑鰓金龜這種日趨嚴重的優(yōu)勢種群，可以更好地控制其發(fā)生和危害。本研究在高效Bt菌株的篩選過程中，發(fā)現(xiàn)有大量的非高效菌株，其對暗黑鰓金龜幼蟲的致死率大部分在20%～40%之間。雖然沒有進行非高效菌株致死蟲體的病理觀察，但兩者死亡蟲體的外部特征相同，故可推測非高效菌株對暗黑鰓金龜幼蟲的致死病理學與高效菌株的相似，可能非高效菌株的作用時間更長些。

本研究是國際上首次利用透射電鏡技術(shù)，觀察Bt對暗黑鰓金龜幼蟲作用機理，獲得了相關(guān)照片，為今后Bt對暗黑鰓金龜殺蟲機理的分子生物學等方面研究提供了充分有力的圖像依據(jù)。

本項研究所得到的結(jié)果與Bt對其他害蟲作用機理的研究結(jié)果基本相同，都是Bt毒蛋白與中腸細胞作用，破壞其細胞膜的活性，致使中腸損壞，最終導致蟲體死亡［13－16］，與Bt經(jīng)典殺蟲作用機理的表述基本一致。

雖然透射電鏡技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)成熟，但尚不能滿足細胞組織病理學觀察的要求。因為在取樣和制樣過程中，難免對細胞造成一定的損傷，破壞了細胞的某些結(jié)構(gòu)，無法或很難拍攝到病變部位的真實情況，需要大量的切片才能較好地反映病變過程。另外，由于蠐螬生活在地下，在取食的過程中會將土壤一并取食進入中腸，一方面給解剖提取中腸帶來了一定的困難；另一方面試蟲在取食Bt后其中腸圍食膜發(fā)生破損，致使中腸內(nèi)的食物和土壤與中腸混合在一起，形成了類似于結(jié)石狀的物體，在解剖提取的過程中非常難以分離，影響電鏡照片的質(zhì)量。因此，今后尚需開展更加深入的研究。

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Preliminary analysis of the cellular morphological change in the midgut ofHolotrichia parallelalarvae fed with Bt

Zhang Qiang1，2， Wang Yan1， Li Kebin2， Yin Jiao2， Cao Yazhong2， Liu Chunqin3
（1.Jilin Agricultural University，Changchun130118，China； 2.State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193，China；3.Cangzhou Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Cangzhou061001，China）

Transmission electron microscope was used to observe the cellular morphological changein the midgut of theHolotrichia parallelaMotschulsky fed with Bt.The results showed that when the larvae were fed with Bt from one to seven days，a series of change happened to different parts of the midgut.The cell membrane of the midgut cells dissolved on the first day，and disappeared on the seventh day.Other symptoms observed included：the karyotheca dissolved，the nucleolus and the endoplasmic reticulum disappeared.Through a series of changes in the midgut cells，the larvae finally died.

Holotrichia parallela； scarabaeoidea larvae； Bt； midgut cell； transmission electron microscope

S 476

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2011.06.024

2011-01-17

2011-04-24

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項（2009ZX08009-030B）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201003025）

＊ 通信作者 王巖，Tel：0431-84510942，E-mail：wy62＠163.com；曹雅忠，Tel：010-62815619，E-mail：yzcao＠ippcaas.cn