黎卓鍵，劉 麗

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642

草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus）俗稱(chēng)草鯇?zhuān)⑽拿麨镚rass carp，系屬脊椎動(dòng)物門(mén)（Vertebrata）、硬骨魚(yú)綱（Osteichthys）、鯉 形 目（Cypriniformes）、 鯉 科（Cyprinidae）、 雅 羅 魚(yú) 亞 科（Leuciscinae）、草魚(yú)屬（Ctenopharyngodon Steindachner，1866）[1]。草魚(yú)作為四大家魚(yú)之首，其所形成的產(chǎn)業(yè)對(duì)廣東省淡水漁業(yè)乃至全國(guó)的淡水漁業(yè)的發(fā)展都起到了極其重要作用。

隨 機(jī) 擴(kuò) 增 多 態(tài) DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）是建立在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上檢測(cè)DNA序列多態(tài)性和建立分子遺傳標(biāo)記的技術(shù)，Williams等[2]和Welsh等[3]運(yùn)用隨機(jī)引物擴(kuò)增尋找多態(tài)DNA片段作為分子標(biāo)記。如今RAPD技術(shù)在生物的遺傳多樣性、群體遺傳學(xué)、分類(lèi)學(xué)及農(nóng)牧業(yè)的遺傳育種等研究中得到廣泛應(yīng)用[4]。本研究旨在用RAPD技術(shù)對(duì)廣東草魚(yú)進(jìn)行群體的親緣關(guān)系探討，以期為了解廣東省草魚(yú)資源現(xiàn)狀提供相關(guān)的遺傳背景資料和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

2008年5 月～2008年7月于西江肇慶江段、東江新豐江水庫(kù)和佛山龍江鎮(zhèn)錦記魚(yú)苗場(chǎng)共取90尾草魚(yú)個(gè)體的背部肌肉放在凍存管置于液氮罐，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室液氮保存。采集點(diǎn)分布見(jiàn)圖1，采集信息見(jiàn)表1。

圖1 樣品采集地點(diǎn)

表1 草魚(yú)采樣信息

1.2 DNA提取

取液氮保存肌肉組織大約10mg，與200μl細(xì)胞裂解液混勻，加入1.5μl蛋白酶K[5]，置于55℃水浴鍋中消化過(guò)夜。從水浴鍋中取出，加入300μl三氯甲烷混勻，上下?lián)u動(dòng)10min～15 min。10 000×g離心2min，取約200μl上清液，置于1.5 ml心管中。在離心管中加入250μl沉淀液，混勻，室溫放置2 min，10 000×g離心2min。倒掉上清液，立即加入50μl 2M NaCl，輕輕振蕩直至DNA樣品完全溶解，加入1.5μl RNase A，然后置于37℃水浴鍋中水浴5min～10min。加入150μl冷乙醇，-20℃放置10min，10 000×g離心4 min，倒掉乙醇，加入300μl 75%乙醇清洗，10 000×g離心2 min，倒掉75%乙醇，自然風(fēng)干至無(wú)酒精味，加入50μl TE，37℃水浴鍋中水浴溶解，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 隨機(jī)引物及篩選

從已研究草魚(yú)的RAPD文獻(xiàn)中選取60條引物，以高純度的草魚(yú)基因組DNA為模板，對(duì)60個(gè)引物進(jìn)行篩選，從中選取擴(kuò)增條帶多且清晰的7個(gè)隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表2 7個(gè)引物的名稱(chēng)和序列

1.4 RAPD-PCR“標(biāo)準(zhǔn)”反應(yīng)體系

擴(kuò)增條件為: 94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，36℃退火1min，72℃延伸2min，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上，用恒壓80V電泳1小時(shí)，溴化乙錠染色，紫外透射儀下觀察并照相。根據(jù) 50bp DNA ladder（takara）對(duì)擴(kuò)增的片段進(jìn)行確認(rèn)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 RAPD片段的觀察與統(tǒng)計(jì)

根據(jù)PCR產(chǎn)物的電泳帶型，進(jìn)行群體內(nèi)和群體間的比較。統(tǒng)計(jì)時(shí)僅記錄清晰、穩(wěn)定的電泳帶。在同一個(gè)引物相同的遷移率上，不同個(gè)體間出現(xiàn)的帶記為1，未出現(xiàn)的帶記為0，在excel表中按格式輸入每一個(gè)引物的0、1距陣。

1.5.2 多態(tài)位點(diǎn)比例

利用擴(kuò)增片段原始數(shù)據(jù)的0-1矩陣，使用RAPD data analyzer 1.3v數(shù)據(jù)分析軟件，計(jì)算群體內(nèi)個(gè)體間的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)和總位點(diǎn)數(shù)，然后根據(jù)如下公式計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)比例：多態(tài)位點(diǎn)比例（P）=多態(tài)位點(diǎn)數(shù)/總位點(diǎn)數(shù)×100%

1.5.3 遺傳相似度和遺傳距離

根據(jù)統(tǒng)計(jì)的原0-1矩陣，進(jìn)行個(gè)體間與群體間的比較分析。按公式Sxy=2nxy/（nx+ny）計(jì)算出個(gè)體間遺傳相似性指數(shù)（nxy是個(gè)體x和y的共有帶數(shù)，nx和ny分別是個(gè)體x和y擴(kuò)增的擴(kuò)增帶數(shù)）。

群體間的相似性指數(shù)（Sij）為種群i中的個(gè)體和種j中的個(gè)體隨機(jī)組合所得的相似指數(shù)和平均值[6-7]。用公式D=1-S計(jì)算個(gè)體間及種間的遺傳距離。最后用MEGA2. 1軟件的類(lèi)平均聚類(lèi)法（unweighed pair-groupmethod of analysis， UPGMA） 和 鄰 接 法（neighbor joining， NJ）對(duì)0-1矩陣值進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.5.4 Shannon遺傳多樣性指數(shù)

種群內(nèi)的遺傳分化可用Shannon遺傳多樣性指數(shù)進(jìn)行估算，指數(shù)越大遺傳多樣性越大，種群分化的程度越高。每個(gè)RAPD多態(tài)位點(diǎn)上，可擴(kuò)增出的帶出現(xiàn)頻率是p（出現(xiàn)次數(shù)/個(gè)體總數(shù)），不能擴(kuò)增出的帶頻率是q，其中p+q=1。根據(jù)RAPD各多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率，應(yīng)用下列公式計(jì)算Shannon遺傳多樣性指數(shù)指數(shù) H，從而估算種群內(nèi)的遺傳距離。用公式：H =-∑ pi Ln pi進(jìn)行計(jì)算，即每個(gè)RAPD多態(tài)位點(diǎn)上帶出現(xiàn)的頻率p，取Ln為自然對(duì)數(shù)。∑是每個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的值求和[8]。

2 結(jié)果

2.1 模板DNA的檢測(cè)

圖2 草魚(yú)群體基因組DNA瓊脂糖凝膠（0.7%）電泳圖

本實(shí)驗(yàn)提取得到的DNA，經(jīng)0.7%的瓊脂糖凝膠電泳顯示DNA帶型致密，分子量較大，約在20kb左右，符合RAPD對(duì)模板DNA質(zhì)量的要求。圖2顯示的是草魚(yú)群體基因組DNA瓊脂糖凝膠（0.7%）電泳圖

2.2 RAPD擴(kuò)增結(jié)果

在選用的60個(gè)隨機(jī)引物中，有53個(gè)引物無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物或因結(jié)果不穩(wěn)定無(wú)法做進(jìn)一步分析。其余7個(gè)隨機(jī)引物在3個(gè)群體的90個(gè)個(gè)體中擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性佳，共在西江草魚(yú)群體中檢測(cè)到62個(gè)位點(diǎn)、在東江草魚(yú)群體中檢測(cè)到59個(gè)位點(diǎn)、在良種場(chǎng)草魚(yú)群體中檢測(cè)到56個(gè)位點(diǎn)，檢測(cè)到的平均位點(diǎn)數(shù)分別為西江8.86，東江8.43，良種場(chǎng)8個(gè)，得出3個(gè)草魚(yú)群體的多態(tài)位點(diǎn)比例分別為21.00%，18.64%，33.96%。其多態(tài)位點(diǎn)比例的大小順序?yàn)椋毫挤N場(chǎng)草魚(yú)〉西江草魚(yú)〉東江草魚(yú)。

表3 RAPD擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)以及多態(tài)位點(diǎn)比例

引物5在西江草魚(yú)群體的RAPD擴(kuò)增物瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳圖

注：1.50bp分子量標(biāo)準(zhǔn)；2～16.引物5在西江草魚(yú)群體的擴(kuò)增條帶箭頭所示西江和東江草魚(yú)群體中檢測(cè)到而良種場(chǎng)草魚(yú)群體中沒(méi)有檢測(cè)到的特異譜帶（約200bp處）

引物5在東江草魚(yú)群體的RAPD擴(kuò)增物瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳圖

注：1.50bp分子量標(biāo)準(zhǔn)；2～15.引物5在東江草魚(yú)群體的擴(kuò)增條帶箭頭所示西江和東江草魚(yú)群體中檢測(cè)到而良種場(chǎng)草魚(yú)群體中沒(méi)有檢測(cè)到的特異譜帶（約200bp處）

引物5在良種場(chǎng)草魚(yú)群體的RAPD擴(kuò)增物瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳圖

注：1. 50bp分子量標(biāo)準(zhǔn)；2～14. 引物5在良種場(chǎng)草魚(yú)群體的擴(kuò)增條帶良種場(chǎng)草魚(yú)群體中在約200bp處沒(méi)有檢測(cè)到相應(yīng)的特異譜帶

圖3 引物5在3種魚(yú)群體基因組的RAPD-PCR擴(kuò)增圖譜

2.3 3個(gè)草魚(yú)群體的群體內(nèi)遺傳相似度和遺傳距離

運(yùn)用NTSYS-pc 2.2軟件計(jì)算3個(gè)草魚(yú)群體內(nèi)的遺傳相似度和遺傳距離，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4中可以看出遺傳相似系數(shù)在0.8863～0.9811，平均值為0.9435。這3個(gè)草魚(yú)群體內(nèi)的遺傳距離大小順序恰恰相反，其大小順序?yàn)榱挤N場(chǎng)草魚(yú)群體〉西江草魚(yú)群體〉東江草魚(yú)群體

表4 三個(gè)草魚(yú)群體內(nèi)的遺傳相似度和遺傳距離

2.4 Shannon遺傳多樣性指數(shù)

用Shannon遺傳多樣性指數(shù)計(jì)算了3個(gè)草魚(yú)群體的群體內(nèi)遺傳多樣性，其結(jié)果見(jiàn)表5。由于不同的隨機(jī)引物檢測(cè)到的位點(diǎn)數(shù)及多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)均有所不同，按各個(gè)引物計(jì)算的遺傳多樣性指數(shù)值就有一定的差異，因此計(jì)算各個(gè)引物的Shannon遺傳多樣性指數(shù)后求出其平均值。

表5 三個(gè)草魚(yú)群體的群體內(nèi)的Shannon遺傳多樣性指數(shù)

Shannon遺傳多樣性指數(shù)越大表明遺傳多樣性越大，種群分化的程度越高。數(shù)據(jù)結(jié)果表明：良種場(chǎng)的草魚(yú)群體遺傳多樣性〉西江草魚(yú)群體遺傳多樣性〉東江草魚(yú)群體遺傳多樣性。其結(jié)果和表4計(jì)算所得3個(gè)草魚(yú)群體內(nèi)的遺傳距離的結(jié)果是相吻合的。

2.5 3個(gè)草魚(yú)群體間的遺傳相似度和遺傳距離

通過(guò)對(duì)RAPD譜帶的比較和分析，分別計(jì)算出草魚(yú)3個(gè)群體間的遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 草魚(yú)三個(gè)群體間的遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離

如表6所示，群體間遺傳相似性指數(shù)西江和東江之間最大，為0.9454；東江和良種場(chǎng)次之，為0.8821；西江和良種場(chǎng)之間最低，為0.8532。群體間的遺傳距離良種場(chǎng)和西江之間最大，為0.1468；良種場(chǎng)和東江之間次之，為0.1179；西江和東江之間最小，為0.0546。草魚(yú)群體間的平均遺傳距為0.1064，并根據(jù)表的遺傳距離，構(gòu)建聚類(lèi)圖（圖4）。西江、東江草魚(yú)群體先聚為一類(lèi)，然后再與良種場(chǎng)草魚(yú)群體相聚。

圖4 3個(gè)草魚(yú)群體遺傳距離聚類(lèi)圖

3 討論

聚類(lèi)分析可以對(duì)物種的親緣疏遠(yuǎn)關(guān)系進(jìn)行比較，量化種群間的差異程度。形態(tài)距離的聚類(lèi)分析結(jié)果表明，西江和東江之間的距離最近，形態(tài)也很相近，良種場(chǎng)群體和西江、東江這兩個(gè)群體之間在形態(tài)上有一定差異。魚(yú)類(lèi)形態(tài)特征很大程度上取決于遺傳特性。而魚(yú)類(lèi)形態(tài)學(xué)性狀也與魚(yú)類(lèi)生活成長(zhǎng)環(huán)境條件相緊密聯(lián)系的。形態(tài)性狀的穩(wěn)定與演化，都是魚(yú)類(lèi)對(duì)特定棲息環(huán)境條件的長(zhǎng)期適應(yīng)，在生活習(xí)性、形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能等方面發(fā)生相適應(yīng)的變化。形態(tài)性狀是與生理機(jī)能、生活習(xí)性的變化相一致的。綜合分析結(jié)果表明：在形態(tài)方面，3個(gè)草魚(yú)群體內(nèi)差異不大，而東江和西江草魚(yú)群體間差異不大，這兩個(gè)地方群體與良種場(chǎng)群體間有一定差異，這同它們來(lái)源差異是相符合的，也可能與遺傳背景有關(guān)。要從形態(tài)上對(duì)不同地方草魚(yú)進(jìn)行區(qū)分不能要求只用少數(shù)指標(biāo)就能鑒別，而要用多項(xiàng)參數(shù)綜合判別。本實(shí)驗(yàn)對(duì)3個(gè)草魚(yú)群體在分子水平進(jìn)行種質(zhì)鑒定研究是為了盡最大可能研究不同地方草魚(yú)遺傳變異的水平；研究草魚(yú)物種的進(jìn)化潛力；生物資源的永續(xù)利用，為草魚(yú)資源的生產(chǎn)利用提供依據(jù)。

由于新豐江水庫(kù)是90世紀(jì)60年代蘇聯(lián)援建，因此建庫(kù)已超過(guò)50年。結(jié)果導(dǎo)致新豐江水庫(kù)的野生草魚(yú)屬于一個(gè)比較密閉的群體，它和西江野生的草魚(yú)群體在形態(tài)分析上的相似性比較大，而這兩個(gè)地方的草魚(yú)與良種場(chǎng)的草魚(yú)在形態(tài)上有一定的差異。這與所采良種場(chǎng)的草魚(yú)是來(lái)自長(zhǎng)江水系的是相吻合的。因?yàn)樵谥榻祷旧蠜](méi)有草魚(yú)產(chǎn)卵場(chǎng)，草魚(yú)的產(chǎn)卵場(chǎng)基本在長(zhǎng)江中游[9]。

魚(yú)類(lèi)物種是以種群的形式而存在的，不是個(gè)體的隨意綜合，而是分別結(jié)合成或大或小的種群，種群之間并不是以連續(xù)的方式存在，組成一個(gè)統(tǒng)一的繁殖群體。在逐漸形成一個(gè)穩(wěn)定群體的過(guò)程中，魚(yú)類(lèi)種群由于突變后的自然選擇而出現(xiàn)變異和進(jìn)化。魚(yú)類(lèi)種群的遺傳變異水平是衡量魚(yú)類(lèi)資源狀況和遺傳背景的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)研究掌握現(xiàn)有魚(yú)類(lèi)資源的遺傳多樣性，對(duì)不同生物群體進(jìn)行鑒別，從而可以清楚地掌握種群的分布；可以知道各個(gè)群體之間的親緣關(guān)系。遺傳多樣性的降低將導(dǎo)致其適應(yīng)能力降低，有害隱性基因增加及經(jīng)濟(jì)性狀衰退，會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的遺傳瓶頸效應(yīng)，最后導(dǎo)致物種退化。因此，檢測(cè)種群的遺傳變異和多樣性水平是十分必要的。迄今為止，已有多種不同的檢測(cè)手段檢測(cè)遺傳變異水平，RAPD分子標(biāo)記技術(shù)由于其操作簡(jiǎn)便，產(chǎn)生的多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，可以直接檢測(cè)基因組中的變異情況，為種群和種群內(nèi)個(gè)體之間的遺傳多樣性研究提供有力的手段

目前己有不少學(xué)者應(yīng)用RAPD技術(shù)對(duì)草魚(yú)進(jìn)行了遺傳多樣性分析[10-11]。薛國(guó)雄等[10]對(duì)長(zhǎng)江、珠江、黑龍江三江水系的草魚(yú)種群進(jìn)行RAPD分析結(jié)果表明:每一水系的草魚(yú)種群均有其特征性基因圖譜，可作為種群鑒定的依據(jù)。章懷云[12]等對(duì)草魚(yú)和紅鯉進(jìn)行了RAPD分析，結(jié)果表明草魚(yú)的遺傳多樣性明顯低于紅鯉。目前在草魚(yú)的多樣性研究中，不同方法得到的研究結(jié)果均顯示草魚(yú)的遺傳多樣性不豐富[11-13]。張四明[11]采用RAPD技術(shù)對(duì)長(zhǎng)江中游的湖北嘉魚(yú)與江西瑞昌兩個(gè)地理群體和中游的漢江和湘江兩大水系的鰱魚(yú)和草魚(yú)的群體進(jìn)行了遺傳學(xué)研究。發(fā)現(xiàn)草魚(yú)遺傳多樣性從大到小的分布是瑞昌、漢江、湘江、嘉魚(yú)，四個(gè)地理群體草魚(yú)的遺傳分化度較低，可能與地理位置較近和基因交流頻繁有關(guān)；草魚(yú)有可能在歷史上經(jīng)歷了“遺傳瓶頸”效應(yīng)，推測(cè)草魚(yú)很有可能是一個(gè)遺傳多樣性貧乏的常見(jiàn)物種[14]。

本實(shí)驗(yàn)中，利用7個(gè)引物對(duì)珠江水系西江和東江草魚(yú)群體進(jìn)行RAPD分析，并以良種場(chǎng)草魚(yú)群體作為對(duì)照，得到的結(jié)果為：草魚(yú)群體間的遺傳距離西江和良種場(chǎng)之間最大，為0.1468；東江和良種場(chǎng)之間次之，為0.1179；西江和東江之間最小，為0.0546。3個(gè)草魚(yú)群體內(nèi)的遺傳差異很小，草魚(yú)的遺傳多樣性很低，和已有的研究結(jié)果相符。今后研究過(guò)程中，應(yīng)采用不同方法（形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)），從不同層次上（群體、個(gè)體、細(xì)胞、分子水平）進(jìn)行研究，并且進(jìn)行綜合分析，使人們對(duì)所研究的對(duì)象有一個(gè)更加全面準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)，以便更好的利用草魚(yú)魚(yú)類(lèi)資源。

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