張 克，姜 維，周 建，陶 然，李溢柔，李 進(jìn)，馬世武*，侯金林

(1南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院，廣州 510515;2深圳源興生物醫(yī)藥科技有限公司)

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK細(xì)胞)已經(jīng)應(yīng)用于腫瘤的臨床治療［1，2］，其體外大量擴(kuò)增及維持這些細(xì)胞的表型和功能，在過(guò)繼免疫治療中至關(guān)重要。目前體外活化人T細(xì)胞的抗CD3單克隆抗體主要包括鼠源性 IgG1(UCHT1)、IgG2a(OKT3)抗體。既往研究發(fā)現(xiàn)，同種異型抗CD3單克隆抗體體外刺激 T細(xì)胞的結(jié)果是不同的［3］，但在體外誘導(dǎo)CIK細(xì)胞方面是否存在差異尚不清楚。2011年1月，本研究觀察了同種異型抗 CD3單克隆抗體(UCHT1、OKT3)體外擴(kuò)增 CIK細(xì)胞，并比較其對(duì)CIK細(xì)胞擴(kuò)增效率、細(xì)胞表型及功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 淋巴細(xì)胞分離液(LymphoprepTM);IFN-γ、IL-1a、IL-2(PeproTech);UCHT1(RδD);OKT3(Cuba CJMAB S.A);PAA淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液(PAA);CD3-FITC、CD56-PE、CD8-PE-Cy5(BD);25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning);CytoTox 96?非放射性細(xì)胞毒檢測(cè)試劑盒(Promega);細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO，MCO-20AIC);流式細(xì)胞儀(BD FACSCantoⅡ);細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(CytometerTM，Nexcelom Bioscience);倒置相差顯微鏡(Nikon ELIPSE Ti)。

1.2 方法

1.2.1 CIK細(xì)胞的體外培養(yǎng) 采集7例健康青年志愿者外周靜脈血20 ml，肝素抗凝。常規(guī)密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，加入含1%自體血漿及1000 U/ml IFN-γ的PAA培養(yǎng)基，接種于5 cm×5 cm細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞密度為2×106個(gè)/ml，培養(yǎng)基體積為 5 ml，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，共接種2瓶;第2天，兩培養(yǎng)瓶中分別加入50 ng/ml UCHT1、OKT3，并同時(shí)加入100 U/ml IL-1α及1000 U/ml IL-2的PAA培養(yǎng)基，定期加入含1000 U/ml IL-2的PAA培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/ml。

1.2.2 細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)觀察 應(yīng)用數(shù)胞計(jì)數(shù)儀于培養(yǎng)后第3、7、10、12、14、21 天觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)(擴(kuò)增倍數(shù)=細(xì)胞密度×培養(yǎng)基體積÷接種細(xì)胞總量)。

1.2.3 CIK細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè) 選取培養(yǎng)基線和培養(yǎng)第14天的CIK細(xì)胞，取1×106個(gè)細(xì)胞置于流式檢測(cè)管中，1500 r/m離心5 min，洗滌細(xì)胞2次，加入流式單克隆抗體 CD3-PE、CD56-FITC和 CD8-PE-Cy5各10 μl，并設(shè)同型對(duì)照，4℃避光孵育30 min;1 ml PBS溶液離心洗滌2次，加入2%多聚甲醛200 μl重懸細(xì)胞并固定20 min，流式細(xì)胞儀分析。

1.2.4 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn) 按照試劑盒說(shuō)明，均為3個(gè)復(fù)孔，調(diào)整CIK細(xì)胞密度為4×106/ml，取200 μl接種于96孔圓底板內(nèi)，之后倍比稀釋，細(xì)胞總量依次為4 ×105、2 ×105、1 ×105、0.5 ×105，調(diào)整K562 細(xì)胞密度為1×105/ml，取100 μl加入到實(shí)驗(yàn)孔，細(xì)胞總量1 ×104，實(shí)驗(yàn)孔效靶比分別為40∶1、20∶1、10∶1、5∶1，并設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞、靶細(xì)胞自釋放孔，培養(yǎng)基、容積對(duì)照孔，靶細(xì)胞最大釋放孔，每孔總體積為200 μl，250 g離心4 min，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。反應(yīng)停止前45 min，在靶細(xì)胞最大釋放孔加入細(xì)胞裂解液 20 μl。250 g 離心 4 min，吸取上清 50 μl置于96孔平底板中，每孔加入顯色液50 μl，室溫避光30 min，加入終止液 50 μl，全自動(dòng)酶聯(lián)檢測(cè)儀490 nm測(cè)各孔的吸光度A值。結(jié)果計(jì)算公式:殺傷率(%) =(A實(shí)驗(yàn)孔－ A效應(yīng)細(xì)胞自釋放孔－ A靶細(xì)胞自釋放孔)/(A靶細(xì)胞最大釋放孔－A靶細(xì)胞自釋放孔) ×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以表示，計(jì)量資料比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIK細(xì)胞的體外增殖 兩組對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間CIK細(xì)胞增殖倍數(shù)的比較見(jiàn)表1。

表1 UCHT1及OKT3對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間CIK細(xì)胞增殖倍數(shù)的比較()

表1 UCHT1及OKT3對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間CIK細(xì)胞增殖倍數(shù)的比較()

注:與 UCHT1組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 n 第3天 第7天 第10天 第12天 第14天 第21天UCHT1 組 7 0.8 ±0.1 3.0 ±4.1 4.0 ±1.6 8.9 ± 4.7 13.3 ± 5.9 33.7 ± 20.9 OKT3 組 7 0.7 ±0.2 3.0 ±1.2 14.8 ±9.8* 39.9 ±36.1* 69.8 ±43.9＊＊ 470.9 ±451.9*

2.2 CIK細(xì)胞的表面標(biāo)志 培養(yǎng)基線和第14天應(yīng)用流式細(xì)胞染色發(fā)現(xiàn)，基線CD3+細(xì)胞頻數(shù)為(57.30±10.40)%;第 14天時(shí)，OKT3組 CD3+細(xì)胞升至(95.13 ±4.49)%，UCHT1組升至(75.79 ±29.66)%，兩組比較P＞0.05。基線CD3+CD8+細(xì)胞頻數(shù)為(28.82±13.36)%;第 14天時(shí)，OKT3組C細(xì)胞升至(74.94 ±11.45)%，UCHT1 組升至(47.27 ±29.38)%，兩組比較 P ＜0.05?；€細(xì)胞頻數(shù)為(27.17 ±9.32)%;第 14 天時(shí)，OKT3組降至(16.24±13.96)%，而 UCHT1組升至(38.91 ± 25.23)%，兩組比較 P ＜ 0.05?；€細(xì)胞頻數(shù)為(6.00 ±5.66)%;第 14 天時(shí)，OKT3組升至(14.09±14.35)%，UCHT1 組升至(18.29±14.04)%，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。基線細(xì)胞頻數(shù)為(21.59 ±9.99)%;第 14天時(shí)，OKT3組降至(3.03±3.81)%，UCHT1 組為(21.87 ±28.82)%，兩組比較 P ＞0.05。

2.3 CIK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的細(xì)胞毒作用 選取3例進(jìn)行細(xì)胞毒試驗(yàn)，比較兩組細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的毒性作用。當(dāng)效靶比分別為 40∶1、20∶1、10∶1、5∶1時(shí)，OKT3 組、UCHT1 組分別為(9.46 ±8.90)%vs(50.13 ± 14.00)%、(5.01 ± 5.02)%vs(44.65 ±11.63)%、(2.85 ±2.85)%vs(27.28 ±12.05)%、(1.18 ±1.18)%vs(11.84 ±10.48)%。當(dāng)效靶比為20∶1時(shí)，兩組比較 P=0.078，結(jié)果提示:對(duì) K562的細(xì)胞毒作用，UCHT1組有高于OKT3組的趨勢(shì)。其余各效靶比比較，雖然UCHT1組對(duì)K562的殺傷率均高于OKT3組，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

1991年Schmidt-Wolf在CD3激活的殺傷細(xì)胞基礎(chǔ)上制備出了一類新型免疫細(xì)胞，即CIK細(xì)胞，CIK細(xì)胞是人外周血單核細(xì)胞在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子刺激后獲得的異質(zhì)細(xì)胞群，由于該細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子，故又稱為NK細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞，兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和自然殺傷細(xì)胞非主要組織相容性復(fù)合體限制等特點(diǎn)。體外誘導(dǎo)、培養(yǎng)CIK細(xì)胞需要多種細(xì)胞因子，包括抗 CD3單抗、IFN-γ、IL-1a、IL-2等。目前應(yīng)用較多的抗 CD3單抗為 UCHT1、OKT3。UCHT1及OKT3均為鼠源性抗CD3單克隆抗體，其中UCHT1是IgG1型抗體，而OKT3是IgG2a型抗體。OKT3、UCHT1是同種異型的單克隆抗體，通過(guò)與CD3分子緊密結(jié)合，識(shí)別CD3分子的ε亞基，從而活化T細(xì)胞［4，5］。盡管不同亞型的抗CD3單克隆抗體均作用于相同的CD3分子ε亞單位，但是由于Fc受體的不同，使得不同亞型的抗CD3單克隆抗體對(duì)T細(xì)胞的活化作用也不盡相同［6，7］。本研究比較同種異型的抗CD3單抗對(duì)CIK細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)、表型及對(duì)K562細(xì)胞殺傷作用，尋找何種亞型的抗CD3單抗更適合體外誘導(dǎo)、培養(yǎng)CIK細(xì)胞。

我們研究發(fā)現(xiàn)，OKT3擴(kuò)增CIK細(xì)胞總數(shù)明顯高于 UCHT1，其主要成為 CD3+CD8+細(xì)胞，而相對(duì)細(xì)胞的頻數(shù)較低。細(xì)胞毒試驗(yàn)顯示，UCHT1組的殺傷效果較OKT3組有增強(qiáng)的趨勢(shì)，這提示了CIK細(xì)胞中高比例的細(xì)胞可能較 CD3+CD8+對(duì)于殺傷腫瘤細(xì)胞更加重要。為此，獲得高比例的細(xì)胞可能對(duì)CIK細(xì)胞培養(yǎng)是重要的。

過(guò)繼免疫治療一方面需要保證擴(kuò)增細(xì)胞的數(shù)量，但更重要的是保證細(xì)胞的質(zhì)量。本研究評(píng)價(jià)了兩種不同亞型的抗CD3單克隆抗體對(duì)CIK細(xì)胞擴(kuò)增的影響，不同亞型的抗CD3單克隆抗體對(duì)CIK細(xì)胞擴(kuò)增效率、表型及細(xì)胞毒功能方面都是不同的。在應(yīng)用CIK細(xì)胞作為過(guò)繼免疫治療時(shí)，在保證細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的情況下，選擇UCTH1能體外誘導(dǎo)出殺瘤活性更強(qiáng)的CIK細(xì)胞，因此更適合于體外培養(yǎng)CIK細(xì)胞。OKT3擴(kuò)增CIK細(xì)胞數(shù)量多但功能弱的原因尚不清楚，今后應(yīng)進(jìn)一步探討發(fā)生此現(xiàn)象的機(jī)制。

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