晏 淼，朱正秋，卞保祥，鄭義同

胃癌的死亡率在世界范圍內(nèi)居高不下，主要原因之一是胃癌的治療進展緩慢，手術(shù)、放療及化療均不能取得滿意效果，最終死于腫瘤復發(fā)及轉(zhuǎn)移。自從靶向治療問世后，獲得了學者的廣泛關(guān)注，也取得了不錯的效果。目前，信號傳導系統(tǒng)的缺陷和異?；罨c腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預后的關(guān)系已成為腫瘤分子生物學的研究熱點，通過干預信號傳導途徑治療也成為生物治療的新興領(lǐng)域。在這些信號傳導通路中，Akt/mTOR信號通路是關(guān)鍵的細胞增殖相關(guān)信號通道之一，其活性的明顯增強與許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究采用PV－9000二步法免疫組化檢測Akt/mTOR信號通路蛋白在胃癌組織中的表達情況，并結(jié)合臨床病理特征進行探討，以期為下一步臨床應(yīng)用提供理論及實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例納入標準 (1)組織病理學診斷結(jié)果經(jīng)2名以上病理醫(yī)師確診為胃癌，胃癌的組織學類型以世界衛(wèi)生組織(WHO)分類2000為準;(2)有明確的胃癌TNM分期和組織學分級，以美國癌癥聯(lián)合會 (AJCC)2010年第7版為準;(3)行根治性手術(shù);(4)術(shù)前均未經(jīng)放療或化療。

1.2 標本 收集2009年9月—2010年9月連云港市第一人民醫(yī)院手術(shù)切除的胃癌蠟塊標本93例 (實驗組)，病例均符合上述納入標準。其中男67例，女26例;年齡26～83歲，平均61歲。從93例患者中隨機抽取40例，取其癌旁組織 (距腫瘤組織邊緣5 cm以上)作為對照組，其中男26例，女14例;年齡36～79歲，平均61歲。

1.3 主要試劑及方法 兔抗人多克隆抗體p－Akt、兔抗人單克隆抗體p－mTOR、PV－9000檢測試劑均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。采用PV－9000二步法免疫組化檢測，實驗步驟按照說明書嚴格操作，用PBS代替一抗做陰性對照。必須同時滿足以下條件才能判斷為陽性，否則為陰性:(1)陽性細胞定位明確;(2)間質(zhì)清晰、無背景著色;(3)陽性細胞占5%以上。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS l7.0軟件進行統(tǒng)計檢驗。計數(shù)資料采用χ2檢驗，并行Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 p－Akt、p－mTOR在胃癌組織和癌旁組織中的表達p－Akt、p－mTOR這兩種蛋白陽性信號主要位于細胞質(zhì)內(nèi)。p－Akt、p－mTOR在實驗組的胃癌組織和對照組的癌旁組織中的陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01，見表1)。

2.2 p－Akt、p－mTOR的表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系93例患者分別按年齡、性別、病理分化程度、侵犯深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期分組，分別統(tǒng)計組間p－Akt、p－mTOR的表達情況。結(jié)果顯示，不同分化程度、侵犯深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期組組織中p－Akt、p－mTOR的表達差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)，而在年齡、性別不同分組中的表達間差異則無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05，見表2)。

表1 實驗組和對照組中p－Akt、p－mTOR的表達［n(%)］Table 1 Expression of p－Akt and p－mTOR in the observed group and the control group

表2 p－Akt、p－mTOR陽性表達與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Table 2 Correlations between positive expression of p－Akt and p－mTOR and clinicopathologic features of gastric carcinoma

2.3 p－Akt與p－mTOR在胃癌組織中表達的相關(guān)性Spearman相關(guān)分析顯示，胃癌組織中p－Akt蛋白表達與pmTOR蛋白表達呈正相關(guān) (r=0.327，P＜0.01，見表3)。

表3 93例胃癌組織中p－Akt、p－mTOR的表達 ［n(%)］Table 3 Expression of p－Akt and p－mTOR in 93 gastric carcinomas specimens

3 討論

3.1 Akt/mTOR信號通路是關(guān)鍵的細胞增殖相關(guān)信號通道之一，其活性增強與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1］。Akt又被稱為蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一個在進化上高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶。在哺乳動物細胞中存在著3種Akt異構(gòu)體 (Akt 1～3)，這3種由不同基因編碼的蛋白擁有80%的序列一致性，并且功能大部分相同。Akt通過殘基Thr308和Ser473的磷酸化而被激活，Akt的活性在多種惡性腫瘤中被放大，其異常激活意味著腫瘤細胞對于凋亡誘導的耐受，細胞增殖、生長、代謝的異常增加。有研究發(fā)現(xiàn)Akt磷酸化主要發(fā)生在胃癌，激活后能延長細胞的生存壽命和增加細胞的增殖，進而促使腫瘤發(fā)展和血管生成［2］。磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol－3－kinase，PI3K) 抑制劑 LY294002能抑制Akt的活性，從而抑制胃癌細胞的生長和增殖，誘導細胞周期G1期停滯。因此，Akt不僅是一個有活性的激酶，并且能促進胃癌的發(fā)展和增殖。Paweletz等［3］檢測疾病發(fā)展中的分子標志物，發(fā)現(xiàn)從正常細胞到不典型增生再到惡性轉(zhuǎn)化，Akt的激活水平漸次增加，而且伴隨凋亡相關(guān)分子標志物丟失，支持Akt在腫瘤發(fā)展中提高腫瘤生存能力的理論。周詩瓊等［4］研究發(fā)現(xiàn)早期胃癌、中晚期胃癌的癌組織中Akt蛋白的陽性表達率均較正常胃黏膜組織高，差異有顯著性。

本研究結(jié)果顯示，p－Akt在胃癌組織中的陽性表達率為54.8%(51/93)，較癌旁組織 (2.5%)高;低分化及未分化(G3+G4)的胃癌組織中p－Akt陽性表達率高于高、中分化(G1+G2)組織，侵犯深度為穿透漿膜層 (T4)的組織p－Akt陽性表達率高于未穿透 (T1+T2+T3)的組織，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (N1+N2+N3)的胃癌組織p－Akt陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (N0)的組織，TNM分期為Ⅲ期和Ⅳ期的高于Ⅰ期和Ⅱ期的。p－Akt蛋白的表達與胃癌細胞的分化程度有關(guān)，可能是因為Akt蛋白的過度擴增促進腫瘤細胞分化、進展。隨著腫瘤侵犯突破漿膜層、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期的提高，p－Akt蛋白的表達陽性率增高，提示p－Akt蛋白的表達促進了胃癌細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移，其機制可能是Akt通過激活其底物來增加細胞周期素 (cyclin)D轉(zhuǎn)錄，還可以通過磷酸化p2lCIPI使細胞周期加速，促進腫瘤發(fā)展。

3.2 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin，mTOR)是一個非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其C末端與PI3K的催化結(jié)構(gòu)域高度同源，因此也屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)蛋白家族。mTOR可以整合氨基酸、能量、生長因子所激發(fā)的信號通路，借以調(diào)控細胞生長增殖和細胞周期，通過控制其下游與翻譯、轉(zhuǎn)錄有關(guān)的多種蛋白的磷酸化來發(fā)揮其生物學作用，在細胞的生存、生長和增殖中起中心調(diào)控作用，其轉(zhuǎn)導的信號通路異常與多種腫瘤的形成密切相關(guān)［5］。Lang等［6］研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路在胃癌組織中表達升高，且雷帕霉素可抑制胃癌細胞的生長和遷徙，并抑制小鼠胃癌生長。孫丹鳳等［7］研究也發(fā)現(xiàn)雷帕霉素干預后可使胃癌細胞生長受到抑制，隨著時間的增加抑制效應(yīng)更顯著，證實mTOR信號通路在胃癌細胞中也發(fā)生改變，可能成為一種潛在的治療靶點。

本實驗檢測p－mTOR在胃癌組織中的陽性表達率為57.0%(53/93)，顯著高于癌旁組織中的陽性表達率(2.5%)，提示這種蛋白可能與胃癌的發(fā)生有關(guān)。而且pmTOR的表達與腫瘤侵犯深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)。結(jié)果表明，p－mTOR的陽性表達率隨著胃癌的浸潤、轉(zhuǎn)移等進展而上調(diào)，提示他們可能參與了胃癌的發(fā)生以及浸潤轉(zhuǎn)移的分子機制，mTOR通過PI3K/Akt信號傳導鏈而作用于細胞分裂、轉(zhuǎn)錄、信號翻譯等細胞增殖的重要環(huán)節(jié)，從而促進腫瘤的發(fā)展。

此外，本研究中Spearman相關(guān)分析顯示，胃癌組織中p－Akt蛋白表達與p－mTOR蛋白表達呈正相關(guān)，可能的原因是它們在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中存在著協(xié)同作用。

3.3 隨著人們逐漸認識到細胞癌變的本質(zhì)是細胞信號轉(zhuǎn)導通路的失調(diào)導致的細胞無限增殖，隨之而來的就是抗腫瘤藥物研發(fā)焦點正在從傳統(tǒng)細胞毒藥物轉(zhuǎn)移到針對腫瘤細胞內(nèi)異常信號系統(tǒng)靶點的特異性的抗腫瘤藥物［8］。本實驗也為Akt/mTOR信號通路蛋白的相關(guān)抑制劑有望成為胃癌新的治療靶點提供了理論依據(jù)。Akt抑制劑哌立福新 (perifosine)、mTOR的抑制劑雷帕霉素及其類似物依維莫司 (RAD001)、CCI779、AP23573等已經(jīng)分別進入各期臨床研究［9－11］。其中，RAD001在既往化療失敗的轉(zhuǎn)移性胃癌中應(yīng)用的Ⅱ期臨床試驗正在進行中，令人期待［12］。Akt/mTOR信號通路蛋白在胃癌組織中的陽性表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有望成為預測胃癌轉(zhuǎn)移的新分子標志物和治療靶點。

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