王曉桃，林文遠(yuǎn)，陳蓓莉，劉健，唐愛林，莫東華

α－干擾素 (interferon－α，IFN－α)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長，增加自然殺傷 (NK)細(xì)胞及其他免疫活性細(xì)胞的功能，具有廣譜的抗腫瘤活性，目前已被廣泛應(yīng)用于血液系統(tǒng)腫瘤的治療。Toll樣受體 (Toll－like receptors，TLRs)是一類介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)并橋接或觸發(fā)適應(yīng)性免疫的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)，TLRs可分布于各種腫瘤細(xì)胞，如結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌細(xì)胞［1］。如TLR1－9在U937細(xì)胞表達(dá)，且TLR8激動劑ssRNA40/LyoVec能明顯抑制U937細(xì)胞的生長［2］。人類TLR8天然或合成的配體能逆轉(zhuǎn)急性髓系白血病 (acute myelogenous leukemia，AML)患者Treg細(xì)胞的免疫抑制作用，進(jìn)而增強抗瘤免疫功能［3］。這些研究提示TLR8配體可能在AML患者的免疫治療中具有重要作用。而作為TLRs主要外源性配體的內(nèi)毒素脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)，需與其受體TLR4結(jié)合后通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)方能產(chǎn)生效應(yīng)。因此，IFN－α+LPS能否協(xié)同阻滯白血病細(xì)胞的增殖及其機制需要進(jìn)一步研究。本研究旨在探討LPS在體外能否增強IFN－α抑制U937細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期的作用及可能機制。為IFN－α協(xié)同TLR激動劑或TLR配體佐劑免疫治療白血病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人AML細(xì)胞株U937(上海細(xì)胞所)自外室購進(jìn)后復(fù)蘇后使用。

1.2 主要試劑與儀器 24孔、96孔培養(yǎng)板 (美國Corning公司);RPMI－Medium1640干粉、胎牛血清 (FBS)(天津血液病研究所);四甲基偶氮唑藍(lán) (MTT)、二甲亞砜 (DMSO)溶液 (北京SABC公司產(chǎn)品);AnnexinV/碘化丙錠 (PI)試劑盒 (德國 Bender公司);Trizol試劑 (Invitroge公司產(chǎn)品);Western blotting化學(xué)發(fā)光試劑盒 (美國SantaCruz公司)，βactin Maker(Fermantas公司)，β－actin小鼠抗人單抗，CyclinA2、CyclinD1兔抗人單抗 (SantaCruz公司);山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG、兔抗山羊IgG(美國SantaCruz公司)。熒光抗體 (美國SantaCruz公司)。自動酶標(biāo)讀數(shù)儀 (國產(chǎn)DG－3022);Fluor ChemTM8900凝膠成像系統(tǒng) (美國Alpha Innotech公司);流式細(xì)胞儀 (美國BD公司)。

1.3 細(xì)胞傳代培養(yǎng) AML細(xì)胞株U937從外室引進(jìn)后，常規(guī)離心棄上清，復(fù)蘇后的細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%的加熱滅活的胎牛血清 (10%FBS) 及100 Μ/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640的培養(yǎng)基中，置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵箱中培養(yǎng)，每3 d更換培養(yǎng)基并傳代一次。本實驗用的細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.4 MTT法檢測各組白血病細(xì)胞的增殖實驗 根據(jù)處理細(xì)胞的藥物不同將實驗組分為單用100 ng/ml IFN－α組、單用100 ng/ml LPS組，按上述劑量1∶1組成IFN－α+LPS組共3組;對照組則為不加任何藥物處理細(xì)胞即空白對照組。按實驗組的藥物劑量處理U937細(xì)胞株，混勻后取0.1 ml加入96孔平底培養(yǎng)板中，使細(xì)胞濃度為5×105/ml，每組重復(fù)8孔，對照組加入等體積培養(yǎng)液，每孔最終體積為200 μl。給藥后置37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液。在終止培養(yǎng)前4 h每孔加入20 μl濃度為5 mg/ml的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，2 000 r/min離心10 min，棄上清液，加150 μl/孔DMSO終止培養(yǎng)，使結(jié)晶溶解。置酶聯(lián)免疫檢測儀下測吸光度值(A)，計算其細(xì)胞生長抑制率〔細(xì)胞生長抑制率 (%) =(l－A處理組/A對照組) ×100%〕，如為對照組，則以第一孔為參照值，其余孔與其對照即可。

1.5 Annexin V FITC/PI雙染色法流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率實驗分組同1.4。將人AML細(xì)胞株U937 0.1 ml置于10%FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至5×106/ml，按實驗分組再在含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中共同培育24 h后，收集細(xì)胞約5×105個，用Binding Buffer洗1次，100 μl Binding Bμffer重懸，加5 μl Annexin V －FITC，避光孵育20 min，再加10 μl PI(PI濃度為1mg/ml)避光室溫下孵育15 min，Binding Buffer洗滌、重懸，立即用流式細(xì)胞儀檢測，每個樣品至少檢測1×105個細(xì)胞。利用Cell Quest功能軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析。每組樣品重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 實驗分組同1.4。將人AML細(xì)胞株U937在無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長周期同步化，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×106/ml，按實驗分組再在含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中共同培育48 h后，600～800 r/min離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，DNA－Prepstain染液染色，用流式細(xì)胞儀檢測，每份樣品約5 000個細(xì)胞，用DNA Multi Cycle軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)擬合分析各組細(xì)胞周期時相。每組樣品重復(fù)3次，取均數(shù)。

1.7 Western blotting檢測CyclinA2和CyclinD1蛋白質(zhì)表達(dá)實驗分組同1.4。將對數(shù)生長期的U937細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至5×105～1×106個/ml。按實驗分組再在含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中共同培育24 h后，每組分別收集1×107個細(xì)胞，1 200 r/min，4℃離心5 min，用冰冷的PBS洗滌3次，再按1 200 r/min，4℃，離心5 min，棄上清液，加入100 μl的細(xì)胞裂解液和 1 μl DTT(1 mol/L)，10 μl PMSF(17.4 ng/ml)裂解細(xì)胞，加熱變性后置于4℃保存。取25 ml蛋白樣品進(jìn)行SDS－PAGE電泳，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用封閉液 (質(zhì)量濃度0.05脫脂奶粉，體積分?jǐn)?shù) 0.001 Tween 20，Tris硼酸緩沖液溶解，pH 7.6)封閉2 h，轉(zhuǎn)移至含約10 ml 7%牛奶，1/2 000一抗的培養(yǎng)皿中孵育4 h，置入含10 ml 7%牛奶，1/3 000二抗的TBST液，室溫反應(yīng)1 h，洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光，X線片曝光顯影。(用β－actin作為內(nèi)參照蛋白)。將各條帶進(jìn)行灰度掃描并與β－actin條帶校正后計算各處理組平均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以 (±s)表示，多均數(shù)比較用單因素方差分析，兩均數(shù)比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFN－α+LPS對白血病細(xì)胞株U937細(xì)胞增殖的抑制作用和凋亡作用 不同藥物與白血病細(xì)胞株U937作用48 h后，抑制率及凋亡率各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (F值分別為42.11和56.43，P＜0.05)。IFN－α組、LPS組及IFN－α+LPS組的抑制率和凋亡率均較對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05);IFN－α+LPS組與IFN－α、LPS組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)，而IFN－α組與LPS組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05，見表1)。

2.2 IFN－α+LPS對U937細(xì)胞周期的影響 IFN－α組、LPS組及IFN－α+LPS組的U937 G1期比例增加、S期和G2期比例減少，而對照組中S期比例偏高、G1期和G2期比例偏少，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=31.62，P＜0.05，見圖2)。IFN－α組、LPS組及IFN－α+LPS組的G1期細(xì)胞較對照組明顯增高 (P＜0.05);IFN－α+LPS組G1期細(xì)胞明顯高于IFN－α、LPS兩組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P值分別為0.02和0.05)。

2.3 IFN－α+LPS對CyclinA2、CyclinD1蛋白質(zhì)的影響 用western blotting方法檢測3組中U9370細(xì)胞株 CyclinA2、CyclinD1蛋白質(zhì)水平的變化情況，結(jié)果如圖3所示。獨立進(jìn)行3次重復(fù)實驗，將各條帶進(jìn)行灰度掃描并經(jīng)β－actin條帶校正后計算各組的平均值，然后用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果表明，IFN－α+LPS組CyclinA2蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)，CyclinD1蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F值分別為56.18和38.42，P＜0.05)，IFN－α組、LPS組及IFN－α+LPS組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)，IFN－α+LPS組與IFN－α組、LPS組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表3)。

表1 α－干擾素和 (或)脂多糖與U937細(xì)胞作用48 h后的抑制率和凋亡率 ( ± s，%)Table 1 The rate of cells inhabtion and apoptosis after IFN－α and/or LPS affection U937 cell lines

表1 α－干擾素和 (或)脂多糖與U937細(xì)胞作用48 h后的抑制率和凋亡率 ( ± s，%)Table 1 The rate of cells inhabtion and apoptosis after IFN－α and/or LPS affection U937 cell lines

0.07±0.03 0.08±0.04 IFN－α組 0.37±0.05 0.31±0.04 LPS組 0.30±0.07 0.25±0.05 IFN－α+LPS組組別 抑制率 凋亡率對照組0.69±0.04 0.51±0.13

圖2 流式細(xì)胞儀檢測U937細(xì)胞周期的改變Figure 2 The change of cell cycle phase induced by IFN－α and/or LPS in cell lines U937

表3 α－干擾素和/或脂多糖對U937對CyclinA2、CyclinD1蛋白質(zhì)表達(dá)的影響Table 3 The expressing of CyclinA2 and CyclinD1 induced by IFN － αand/or LPS in cell lines U937

圖1 Annexin V FITC/PI雙染色法流式細(xì)胞儀檢測U937細(xì)胞凋亡的結(jié)果Figure 1 Cell apoptosis of U937 lines analyzed by FCM with AnnexinⅤ/PI double labeling method

表2 α－干擾素和 (或)脂多糖對U937細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響Table 2 Cell cycle after IFN－α and/or LPS affection U937 cell lines

圖3 Western blotting檢測U937 CyclinA2、CyclinD1蛋白質(zhì)表達(dá)Figure 3 The expression of CyclinA2 and CyclinD1 protein induced by IFN－αand/or LPS in cell lines U937

3 討論

IFN－α是一種非常有效的抗腫瘤細(xì)胞因子，已經(jīng)廣泛用于惡性血液病的治療并有顯著效果［3］。其治療急性白血病的機制主要是通過調(diào)節(jié)宿主免疫學(xué)反應(yīng)的活性作用或通過對腫瘤細(xì)胞增殖的直接抑制作用發(fā)揮抗白血病效應(yīng)［4］。本研究也證實了IFN－α較對照組而言，能顯著抑制細(xì)胞增殖、增加G1期細(xì)胞的比率、減少S期細(xì)胞的比率、增強白血病細(xì)胞凋亡。LPS是革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁組成成分，其受體是TLR4。有研究報道TLR1－8在AML細(xì)胞株U937細(xì)胞均有表達(dá)，且運用TLR8激動劑ssRNA40/LyoVec能顯著抑制U937細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞于G1期，但無明顯的促凋亡作用［5］。本研究發(fā)現(xiàn)100 ng/ml LPS較對照組而言，能顯著抑制U937細(xì)胞增殖，增加G1期細(xì)胞的比率，減少S期細(xì)胞的比率，增加細(xì)胞凋亡率。這與Manfred學(xué)者報道單用LPS能較弱地抑制白血病細(xì)胞增殖、增加細(xì)胞凋亡相一致［6］。本研究中將兩者以1∶1處理白血病細(xì)胞株U937，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合后較單用其中一種，其白血病細(xì)胞的增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率及G1期細(xì)胞均有顯著地提高。這與Manfred等［6］學(xué)者報道IFN－α聯(lián)合LPS能明顯增強白血病細(xì)胞的凋亡相一致。這可能是LPS與U937細(xì)胞作用后，與TLR受體結(jié)合，通過MyD88依賴通路，募集IL－1R相關(guān)蛋白激酶 (IRAK)，經(jīng)由信號分子腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)、p－轉(zhuǎn)化生長因子激活的蛋白激酶 (TAKl)、TAKl結(jié)合蛋白1和2(TAB1，TAB2)進(jìn)入下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，經(jīng)p38、ERK等促分裂原活化的蛋白激酶 (MAPK)途經(jīng)活化激活蛋白－1(AP－1)，誘導(dǎo)細(xì)胞因子如IL－1、IL－6、TNF－α、干擾素的表達(dá)［3］，從而增強IFN－α的抗白血病效應(yīng)，也可能通過Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白 (FADD)依賴的途徑促使白血病細(xì)胞的凋亡、阻滯細(xì)胞于G1期［7］。

細(xì)胞周期分為G1、S、G2、M四個時期，存在G1－S和G2－M期兩個細(xì)胞周期檢測點。其中CyclinD1是Gl期運行的主要參與者，CyclinA2是S期DNA復(fù)制的必需條件，具有調(diào)節(jié)DNA合成及促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂的雙重作用［7］。本研究用IFN－α和 (或)LPS處理細(xì)胞后，白血病細(xì)胞株U937表達(dá)周期素CyclinA2蛋白的細(xì)胞數(shù)較對照組均顯著減少，而表達(dá)周期素CyclinDl蛋白的細(xì)胞數(shù)較對照組明顯增加。提示IFN－α能有效地通過調(diào)控CyclinA2和CycllnDl的表達(dá)，減少進(jìn)入S期和M期細(xì)胞的比例，抑制細(xì)胞DNA的復(fù)制合成和細(xì)胞有絲分裂，使細(xì)胞更多地滯留于Gl期，無法進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞增殖，啟動細(xì)胞凋亡或衰老，最終走向死亡，達(dá)到抑制白血病細(xì)胞增殖的目的。將兩者以1∶1處理白血病細(xì)胞株U937，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合后較單用其中一種有顯著地改變。其機制可能是LPS與U937細(xì)胞作用后，激活TLRs的表達(dá)，介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)并橋接或觸發(fā)適應(yīng)性免疫，促使大量的炎癥因子如IL－2、IL－8、CCL2、IFN－α及細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，增強IFN－α的作用，而IFN－α可直接刺激抑癌基因P53的表達(dá)，p53可以激活p21等基因的轉(zhuǎn)錄，p21是一種CKI分子，它能與S－cdk復(fù)合物結(jié)合，從而抑制CyclinA2蛋白的表達(dá)，阻滯細(xì)胞于G1期;也可能是干擾素與干擾素受體結(jié)合后，激活JAK－STAT途徑，促使G1－cdk的蛋白激酶活性增加，增強 CycllnDl蛋白的表達(dá)［8］。

綜上，IFN－α與LPS聯(lián)合使用可協(xié)同增強抗白血病作用，這可為IFN－α協(xié)同TLR激動劑或TLR配體佐劑的使用為臨床免疫治療白血病提供堅實的理論依據(jù)。

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