戴亮 孫宇 李向紅 陳克能

神經(jīng)內(nèi)分泌分化是某些肺癌的一大特點(diǎn)，經(jīng)典的肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（neuroendocrine lung tumor, NELT）包括從典型性類癌（Typical carcinoid, TC）到小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）兩個(gè)極端在內(nèi)的多個(gè)具有NE形態(tài)特征的組織學(xué)類型，此不在本文研究之列。除此之外， NSCLC中存在部分腫瘤雖然不具有光鏡下典型的NE細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)，但相關(guān)NE標(biāo)記物染色陽性并且在電鏡下可見細(xì)胞內(nèi)的NE顆粒，表現(xiàn)出同經(jīng)典NELT相似的特性。WHO將這部分具有NE分化的NSCLC歸為II類NELT[1]。目前，臨床實(shí)踐中對不具有典型光鏡下NE形態(tài)結(jié)構(gòu)的NSCLC不再常規(guī)進(jìn)行相關(guān)NE免疫組化染色，導(dǎo)致人們對這一類腫瘤的診斷、治療及預(yù)后認(rèn)識(shí)不足。

本研究通過對274例手術(shù)治療的NSCLC病例進(jìn)行回顧性分析，用以探討NE相關(guān)免疫組化結(jié)果同臨床、病理特點(diǎn)和預(yù)后的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象 本研究按入組條件共收集2000年1月-2008年11月北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院單一手術(shù)組施行解剖性肺切除手術(shù)的NSCLC共274例，其中男性189例（69%），女性85例（31%），男女比例為2.2：1；年齡29歲-80歲，中位年齡61.5歲；圍手術(shù)期化療173例（63.1%）。按2009年UICC第七版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，I期165例（60.2%），II期48例（17.5%），III期59例（21.5%），IV期2例（0.8%）（表1）。肺葉切除術(shù)231例（84.3%），支氣管/和肺血管袖狀切除及成型肺切除術(shù)26例（9.5%），全肺切除術(shù)17例（6.2%）。根據(jù)2004年WHO肺癌組織學(xué)分型標(biāo)準(zhǔn)，以2位獨(dú)立的資深病理醫(yī)師重新閱片后，腺癌148例（54%），鱗癌103例（37.6%），大細(xì)胞未分化癌13例（4.7%），其它組織學(xué)類型10例（3.6%）。

1.2 免疫組化 芯片制作采用ALPHELYS的Minicore自動(dòng)組織芯片儀，每組標(biāo)本包含4個(gè)癌組織孔及1個(gè)癌旁組織對照孔，孔內(nèi)徑0.6 mm。每組至少1個(gè)癌組織孔癌細(xì)胞 ≥20個(gè)為有效。VENTANA自動(dòng)免疫組化染色，主要試劑、來源及工作濃度詳見表2。結(jié)果由高年資病理科醫(yī)師，單盲判斷各點(diǎn)腫瘤細(xì)胞免疫組化染色情況。各標(biāo)記物分別以細(xì)胞核、細(xì)胞漿或細(xì)胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。Ki-67半定量計(jì)算每個(gè)標(biāo)本孔內(nèi)陽性細(xì)胞率，取4孔平均值為陽性率。NE標(biāo)記物中，一個(gè)標(biāo)記物陽性記1分，陰性記0分，以每例標(biāo)本6個(gè)標(biāo)記物總分為0-6分計(jì)算NE評分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件，單因素分析尋確定預(yù)后因素后，行多因素Cox回歸分析，以NE分化為變量繪制Kaplan-Meier生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)生存差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隨訪結(jié)果 隨訪結(jié)果以死亡日期和本文成稿為止（2010年4月19日），失訪4例，隨訪率98.5%，中位隨訪時(shí)間為29.7個(gè)月（2.2個(gè)月-114.3個(gè)月）。

2.2 免疫組化結(jié)果 癌旁組織孔未見染色，各抗體染色結(jié)果見表3。6種NE標(biāo)記物， 0分108例（39.4%），1分105例（38.3%），2分47例（17.2%），3分13例（4.7%），4分僅1例（0.4%），無5分和6分者。NE評分≥1分166例（60.6%），NE評分≥2分61例（22.3%），評分≥3分14例（5.1%）。Ki-67陽性率≥20%有97例（35.4%）。

2.3 單因素與COX多因素生存分析結(jié)果 將性別、年齡、吸煙指數(shù)、腫瘤部位、圍手術(shù)期是否化療、術(shù)式、病理類型、分化程度、pTNM分期及Ki-67≥20%者行單因素分析，有意義者為pTNM分期（P＜0.001），分化程度（P=0.037），而年齡（70歲，P=0.146），吸煙指數(shù)（P=0.161），Ki-67陽性率（P=0.059），雖未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但考慮其臨床意義仍納入后面COX分析。結(jié)果顯示，CgA與NCAM陽性組樣本少，且全為刪失值，無法統(tǒng)計(jì)，其余4種均不影響NSCLC預(yù)后（表3）。將單因素分析篩選出的各個(gè)因素分別與不同NE評分納入COX回歸多因素分析，建立4個(gè)數(shù)學(xué)模型，最后均得出僅TNM分期為影響本組預(yù)后唯一的獨(dú)立因素。模型1結(jié)果顯示NE評分0分、1分、2分與≥3分各組間生存無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.527）（圖1A）。模型2-模型4結(jié)果顯示NE評分0分與≥1分間（P=0.791）（圖1B），＜2分與≥2分間（P=0.163）（圖1C），＜3分與≥3分間（P=0.293）（圖1D），生存均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表 1 274例NSCLC的單因素生存分析Tab 1 Univariate survival analysis of 274 NSCLCs

2.4 pTNM分層生存分析結(jié)果 考慮pTNM分期為本研究中影響預(yù)后的獨(dú)立因素，為最大程度排除此混雜因素干擾，進(jìn)一步將pTNM分期按I期、II期與III期進(jìn)行分層，單因素分析NE評分在各層對預(yù)后的影響。結(jié)果顯示，對于I期組NE評分0分、1分、2分與≥3分各組間生存無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.735）；NE評分0分與≥1分間（P=0.954），＜2分與≥2分間（P=0.323），＜3分與≥3分間（P=0.558），生存亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表 2 主要試劑、來源及工作濃度Tab 2 Main reagents, sources and working concentrations

表 3 274例NSCLC的NE分化與預(yù)后單因素生存分析Tab 3 NE differentiation univariate survival analysis of 274 NSCLCs

圖 1 不同NE評分NSCLC的生存曲線Fig 1 Cumulative Kaplan-Meier survival curves for different NE scores of NSCLC

2.5 化療組生存分析結(jié)果 圍手術(shù)期化療173例，將單因素分析篩選出的性別、年齡、吸煙指數(shù)、pTNM分期、分化程度、Ki-67等因素分別與不同NE評分納入COX回歸多因素分析，最后結(jié)果顯示無論何種NE評分組合均未對圍手術(shù)期化療患者預(yù)后產(chǎn)生明顯影響（1分、2分、≥3分vs 0分：P=0.692；0分 vs ≥1分：P=0.922；＜2分 vs ≥2分：P=0. 264；＜3分 vs ≥3分：P=0.484）。

3 討論

NSCLC中NE分化與預(yù)后的爭論 由于肺部神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中最常見的SCLC惡性度高、預(yù)后差，分類屬于NSCLC中的LCNEC也同樣表現(xiàn)出與SCLC相似的生物學(xué)特性。因此，臨床慣性思維認(rèn)為“NE分化”就是肺癌高度惡性生物學(xué)行為的“潛臺(tái)詞”。NE分化是否也是NSCLC預(yù)后不良的指標(biāo)之一，學(xué)術(shù)界歷來存在爭論。Pelosi等[2]研究發(fā)現(xiàn)，220例I期NSCLC患者中，NE分化陽性細(xì)胞達(dá)到5%者（至少計(jì)數(shù)2,000個(gè)腫瘤細(xì)胞）其5年生存率要差于無NE分化和NE分化陽性細(xì)胞不足5%者（P=0.017）。但Sterlacci等[3]對405例手術(shù)的NSCLC患者研究顯示，生存期與NE分化無關(guān)。Howe等[4]也認(rèn)為不能用現(xiàn)有的檢測NE分化的免疫化學(xué)指標(biāo)CgA、Syn和NCAM對NSCLC進(jìn)行預(yù)后評價(jià)。更有甚者持完全相反的觀點(diǎn)，Schleusener等[3]研究發(fā)現(xiàn)具有NE分化患者似乎生存期更長，2項(xiàng)或2項(xiàng)以上標(biāo)志物陽性的患者生存期明顯長于NE陰性NSCLC患者。

本研究不支持NE分化是NSCLC高惡性度的指標(biāo) 本研究對6種NE標(biāo)記物分別行單因素生存分析，未發(fā)現(xiàn)任一種抗體能對預(yù)后產(chǎn)生明顯影響，說明不能通過單一NE標(biāo)記物預(yù)測生存。同樣，各種NE評分組合也未在單因素分析中顯示出對預(yù)后的影響。為了排除其它混雜因素的干擾，本研究采用Cox多因素分析模型來分析NE分化與術(shù)后患者的生存關(guān)系。分析結(jié)果顯示無論何種NE評分均未能對預(yù)后產(chǎn)生明顯影響。而在多因素分析中，再次驗(yàn)證了pTNM分期是影響NSCLC預(yù)后的獨(dú)立因素。為此，本研究分別在I期、II期和III期中比較NE評分與預(yù)后的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)對于I期接受手術(shù)治療的患者，無論何種NE評分均未顯示出生存上的差異，說明對于I期NSCLC術(shù)后患者，NE分化同預(yù)后無關(guān)。對于II期和III期的患者，若以至少1種抗體陽性或至少2種抗體陽性作為NE分化的標(biāo)準(zhǔn)，NE分化均同預(yù)后無關(guān)。通過不同的分層及分析方法，各組結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)不同NE評分與NSCLC預(yù)后存在明顯的關(guān)系，因此，我們認(rèn)為，本組樣本中NE分化并非影響手術(shù)治療NSCLC預(yù)后的獨(dú)立因素。

基于以上研究結(jié)果，我們認(rèn)為NE分化僅僅是NE腫瘤在結(jié)構(gòu)、功能上的共同特征，并非是決定此類腫瘤生物學(xué)惡性程度的因素。SCLC生物學(xué)行為高度惡性，生長迅速，早期即可出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后在肺癌中最差；而類癌生物學(xué)行為良好，生存時(shí)間長，同良性腫瘤類似。究其主要原因，在于SCLC屬未分化癌，預(yù)后不良，而TC屬高分化癌，預(yù)后也良好。當(dāng)然，本組研究樣本量較少，隨訪時(shí)間較短，尤其是單一指標(biāo)陽性率太低，陽性病例絕對值太少，不除外隨著樣本量增大及隨訪時(shí)間的延長或更敏感的NE標(biāo)記物的問世而出現(xiàn)與本結(jié)果不同的結(jié)果。但我們認(rèn)為，與TNM分期、分化程度，及典型的I類NELT腫瘤對預(yù)后的影響相比，NSCLC的NE分化至少不是一個(gè)主要的預(yù)后影響因素。

本研究不支持NE分化為NSCLC的化療敏感性指標(biāo)目前，就伴有NE分化的NSCLC是否對化療更敏感的論點(diǎn)國內(nèi)外研究結(jié)論也不盡一致。文獻(xiàn)報(bào)道在影像學(xué)上NSCLC伴NE分化與化療敏感性不相關(guān)。持此觀點(diǎn)者為Graziano等[5]和Schleusener等[6]。但Skov等[7]測定了114例不能手術(shù)的肺腺癌化療患者組織中的CgA和NSE，發(fā)現(xiàn)CgA陽性和陰性患者中對化療敏感的比例分別是30%和19%。因此，認(rèn)為具有NE分化的NSCLC對化療敏感性更高。余少平等[8]認(rèn)為NSCLC伴NE分化者多藥耐藥相關(guān)蛋白的陽性率較低，對化療相對敏感。本研究中圍手術(shù)期化療共173例，結(jié)果顯示無論何種NE標(biāo)記物組合均未體現(xiàn)出顯著的生存差異，但生存曲線提示NE評分越高預(yù)后越好。然而，更為確定的結(jié)論需要增大樣本量及延長隨訪時(shí)間來驗(yàn)證。

從以往的研究中我們發(fā)現(xiàn)對于NE分化的判斷并沒有統(tǒng)一的免疫組化標(biāo)準(zhǔn)。不同的研究不僅在抗體選取、濃度配置及實(shí)驗(yàn)方法上存在差異，但對結(jié)果影響最大的是NE分化判定標(biāo)準(zhǔn)的不統(tǒng)一。鑒于此，為了盡可能減小由于以上差異所帶來的選擇偏倚，本研究選取了6種反映NE分化的標(biāo)記物，不設(shè)定NE分化的免疫組化標(biāo)準(zhǔn)，而是通過不同的評分組合來代表不同的NE分化判定標(biāo)準(zhǔn)。通過該模型進(jìn)行生存分析，解決了NE分化判定標(biāo)準(zhǔn)帶來的誤差，而且大大降低了以往研究抗體選擇不同造成的偏倚。

4 結(jié)論

NSCLC的NE分化對NSCLC的遠(yuǎn)期生存沒有影響，不構(gòu)成為一個(gè)影響遠(yuǎn)期預(yù)后的因素。NSCLC的NE分化也許只代表著這類腫瘤細(xì)胞的形態(tài)特征。本組研究再次肯定了TNM分期與分化程度是影響預(yù)后的主要因素。同時(shí)，治療后良好的生存率再次肯定了較早期NSCLC的治療仍應(yīng)以手術(shù)治療為主。為更寬泛的認(rèn)定NSCLC的NE分化，以便就NE分化的預(yù)后及治療意義作出方向性研究，本研究采用數(shù)學(xué)建模，模糊NE分化判定標(biāo)準(zhǔn)，采用量化的方式（NE評分0分-6分），全面考察不同NE標(biāo)記物及組合對預(yù)后的影響，方法值得借鑒。NSCLC的NE分化需要相關(guān)的免疫組織化學(xué)染色來認(rèn)定。本研究所選用各單一標(biāo)記物的敏感性與特異性均不能達(dá)到很好的統(tǒng)一。因此，如何認(rèn)定這些指標(biāo)的臨床意義，抑或?qū)ふ倚碌闹笜?biāo)仍是此項(xiàng)研究的重點(diǎn)。

致謝：本文成稿感謝北京腫瘤醫(yī)院胸外一科梁震、熊宏超對于臨床資料的收集，馬少華等對肺癌臨床數(shù)據(jù)庫建立的幫助，病理科李忠武、周立新、時(shí)云飛等在病理及免疫組化上提供的支持。