李俊麗，李 涢，劉銘福，張 杰

（中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700）

本研究以中醫(yī)方證相應(yīng)學(xué)說為依據(jù)，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來探尋腎陰虛證標(biāo)志蛋白質(zhì)，以求在蛋白質(zhì)表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)腎陰虛證的物質(zhì)基礎(chǔ)，為證本質(zhì)的研究開辟一條新的研究途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明系小鼠，雄性，購自中國中醫(yī)科學(xué)院動(dòng)物室。

1.1.2 方劑組成及處理 左歸飲：由熟地12g，山藥 6g，枸杞子 6g，炙甘草 3g，茯苓 6g，山萸肉5g組成，上述中藥冷水浸泡30min，煎煮2遍和并煎液，濃縮為 100ml，含生藥 0.38g/ml。

1.1.3 主要試劑 丙烯酰胺（Arc）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、三（羥甲基）氨基乙烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸胺（APS）、二硫蘇糖醇（DTT）、碘代乙酰胺（IAA）、尿素均為Sigma公司產(chǎn)品；硫脲為Fluka公司產(chǎn)品；硫代硫酸鈉、無水碳酸鈉、乙醇、冰醋酸、甘氨酸均為國產(chǎn)分析純；固相 pH梯度干膠條（IPG dry strip PH3～10NL，18cm）及其 IPG緩沖液、蛋白酶抑制劑及蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)及考馬斯亮藍(lán)均購自GE公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 昆明系雄性18月齡小鼠，隨機(jī)分為左歸飲組和老年腎虛證模型組，每組20只。左歸飲組：將左歸飲以8倍人劑量以灌胃形式給予小鼠，每日1次，每灌服6d停藥1d，連續(xù)給藥2個(gè)月。停止給藥時(shí)，小鼠達(dá)20月齡。老年腎虛模型組：以同體積水灌胃小鼠，方法同給藥組。青年正常對(duì)照組：選用2月齡小鼠為青年正常對(duì)照組。

1.2.2 動(dòng)物取材及蛋白質(zhì)提取 給藥結(jié)束后，取小鼠其血清、肝、腎、睪丸組織，置于-80℃保存?zhèn)溆?。蛋白質(zhì)提?。悍謩e快速取各組小鼠肝、腎、睪丸組織約150mg，于液氮中迅速研磨。研磨后轉(zhuǎn)入eppendorf管中，加入 0.5ml組織裂解液（（Tris（40mM），尿素（7M），硫脲（2M），4％CHAPS（兩性離子去污劑），1％二硫蘇糖醇，乙二胺四乙酸二鈉（1mM））。同時(shí)加入 1 ×Cocktail（混合物）蛋白酶抑制劑。將含裂解液的eppendorf埋入冰中，超聲破碎，3～4s/次，間隔 10s左右，至溶液透明。加入DNase I（10μ /μl）、RNase A（10μ /μl）各 5μl，4℃ 靜置 30min。4℃14000r/min，離心 30min。血清去高峰度蛋白處理：選用德國 QIAGEN生產(chǎn)的 Albumin and IgG Depletion試劑盒處理血清高峰度蛋白。取少量上清用 Bradford法測定蛋白濃度，其余上清-80℃保存。

1.2.3 雙向凝膠電泳 第一向等電聚焦（IEF）：使用 pH3～10NL，18cm IPG預(yù)制膠條，在IPG 持膠槽中加入 7μL DTT（1M），1.75μL IPG 緩沖液（pH3～10），組織蛋白提取物（含500μg蛋白），最后加入重泡脹液（8M尿素，4％CHAPS），使總體積為350μL。將IPG膠條置入持膠槽中于聚焦儀上進(jìn)行等電聚焦電泳。電泳條件為：重泡脹（不加電壓）1h；30V電壓 10h；500V、2000V、5000V電壓各30min；最后穩(wěn)定在8000V下進(jìn)行，總電壓時(shí)間積為8萬 Vh。

第二向SDS-PAGE使用自制凝膠在Ettan DALT six Electrophoresis Unit上進(jìn)行電泳。第一向聚焦后的膠條，分別在平衡A液（1mM DTT，50mM Tris pH 8.8 ，6mM 尿素，30％ 甘油，2％SDS ，0.002％ 溴酚蘭）與平衡 B液（2.5％碘乙酰胺，50mMTris pH 8.8 ，6mM 尿素，30％ 甘油，2％SDS，0.002％ 溴酚蘭）中各平衡15min。將平衡后的 IPG膠條轉(zhuǎn)移至13％的聚丙烯酰胺凝膠上端，使IPG膠條與凝膠上端緊密貼合，在一端加入凝膠電泳蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。電泳條件為：每膠20mA 40min后再以每膠30mA電泳，直至溴酚蘭指示線到達(dá)凝膠底邊處停止電泳。

1.2.4 考馬斯亮藍(lán)染色 電泳結(jié)束后取出膠版，考馬斯亮藍(lán) R-350染色液（0.1％）染色1h，考馬斯亮藍(lán)脫色液（7％乙酸5％甲醇）12h。

1.2.5 凝膠圖像分析 凝膠通過 UMAX Power Look 2100XL掃描，凝膠數(shù)據(jù)儲(chǔ)存，采用 Image Master 2D Platinum 6.0軟件進(jìn)行凝膠的蛋白點(diǎn)檢測、背景消減及匹配，配合人工校正等方法，以保證其過程的準(zhǔn)確性。

1.2.6 質(zhì)譜鑒定 切取目的蛋白質(zhì)點(diǎn)送北京華大蛋白質(zhì)組研發(fā)中心，由MALDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲取蛋白樣品的肽質(zhì)量指紋圖，最后應(yīng)用Mascot軟件在人類蛋白質(zhì)公共數(shù)據(jù)庫（NCBI）中搜尋，獲得蛋白質(zhì)的相關(guān)信息。

1.2.7 Western blot驗(yàn)證腎臟標(biāo)志蛋白表達(dá)提取小鼠腎組織總蛋白，用 Braford法檢測蛋白含量，使用 BIO RAD Mini-PROTEAN凝膠電泳儀，樣品濃度為30ug，電泳 1.5 h后取膠，用 BIO RAD轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行濕轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)膜時(shí)濾紙、PVDF膜、膠的位置為：濾紙-膠-PVDF膜-濾紙；轉(zhuǎn)膜條件：14 V 10℃冰柜過夜。轉(zhuǎn)完后放入 Tris-NaCl中清洗10 min轉(zhuǎn)入5％脫脂奶粉中封閉2 h，用PBST洗滌3次，每次10 min，孵一抗室溫 2 h，取出后 PBST洗滌 3次，每次10 min，孵二抗室溫 2 h，PBST洗滌 3次，每次 10 min。然后，在 PVDF膜上加入 ECL Plus底物溶液，用 Image Quant 400凝膠成像儀測化學(xué)發(fā)光。

2 結(jié)果

2.1 雙向凝膠電泳與圖像分析結(jié)果 經(jīng)Image Master 2D Platinum 6.0軟件分析，在相同條件下識(shí)別的蛋白質(zhì)點(diǎn)個(gè)數(shù)肝組織為1484±32個(gè)，腎組織為1301±28個(gè)，血清為 318±34個(gè)，睪丸組織為1027±21個(gè)。根據(jù)3倍差異表達(dá)做為標(biāo)準(zhǔn)，共檢測出左歸飲將腎陰虛模型組非正常表達(dá)的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)糾正為正常表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)為23個(gè)，圖1為各組織蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，圖2為肝組織中異常表達(dá)蛋白質(zhì)各組比較。

2.2 差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定結(jié)果

對(duì)24個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行酶解、質(zhì)譜分析得到PMF圖譜后，查詢 NCBInr 20100928數(shù)據(jù)庫，其中4個(gè)點(diǎn)由于數(shù)據(jù)搜索蛋白的分?jǐn)?shù)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義而未得到鑒定，因此20個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)得到鑒定（結(jié)果如表1）。圖3為5號(hào)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜，檢索 NCBInr20100928數(shù)據(jù)庫顯示為apolipoprotein A-I，圖4為5號(hào)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的分?jǐn)?shù)直方圖，直方圖顯示5號(hào)蛋白質(zhì) apolipoprotein A-I的得分為93分。

圖1 各組織蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜

2.3 Western blot驗(yàn)證肝臟 Arginase-1蛋白和腎臟 Aminoacylase蛋白表達(dá)結(jié)果

Arginase-1蛋白在各組小鼠中均有表達(dá)，在老年腎虛模型組表達(dá)水平較低，明顯低于青年正常對(duì)照組和左歸飲組，說明老年腎虛證小鼠體內(nèi)Arginase-1蛋白表達(dá)較低，經(jīng)左歸飲調(diào)節(jié)后其表達(dá)恢復(fù)正常，這與凝膠分析和質(zhì)譜分析結(jié)果相符（圖5）。Aminoacylase蛋白在各組小鼠中均有表達(dá)，在老年腎虛模型組表達(dá)水平較低，明顯低于青年正常對(duì)照組和左歸飲組，說明老年腎虛證小鼠體內(nèi)Arginase-1蛋白表達(dá)較低，經(jīng)左歸飲調(diào)節(jié)后其表達(dá)恢復(fù)正常，這與凝膠分析和質(zhì)譜分析結(jié)果相符（圖6）

圖2 左歸飲將腎陰虛模型組肝組織中非正常表達(dá)的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)糾正為正常表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)

表1 腎陰虛證小鼠蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果及其表達(dá)變化情況

圖3 5號(hào)差異蛋白質(zhì)apolipoprotein A-I的肽質(zhì)量指紋圖譜

圖4 5號(hào)差異蛋白質(zhì)apolipoprotein A-I的分?jǐn)?shù)直方圖

圖5 各組Arginase-1蛋白的表達(dá)

3 討論

方證相應(yīng)學(xué)說是對(duì)方劑與證候兩者間關(guān)系的一種闡述。方證相應(yīng)指的是一個(gè)方劑的功效和方劑內(nèi)的藥味及其配伍與其所對(duì)應(yīng)的證之間存在著高度的統(tǒng)一性和針對(duì)性［1］。方證相應(yīng)強(qiáng)調(diào)方與證的對(duì)應(yīng)，有是證用是方，方為證立，方隨證轉(zhuǎn)。方證相應(yīng)才是有效方，不對(duì)應(yīng)就是無效方。中醫(yī)經(jīng)過長期的臨床實(shí)踐，逐漸認(rèn)識(shí)和確立了一些典型的證候，在臨床選藥組方治療這些證候時(shí)，經(jīng)長期的反復(fù)驗(yàn)證，形成了一批對(duì)這些證候確有療效的經(jīng)典方劑。這些方劑配伍嚴(yán)謹(jǐn)，指征明確，只要對(duì)證用藥，臨床療效比較肯定。這些方，后世稱之為“經(jīng)方”、“古方”，這些典型的證候和對(duì)這些證候確有療效的經(jīng)典方劑被認(rèn)為達(dá)到了方與證的相應(yīng)，是公認(rèn)的有效方。在此基礎(chǔ)上，我們設(shè)計(jì)出了探尋證候物質(zhì)基礎(chǔ)的新方法：將某一方劑在治療相應(yīng)證候的患者或動(dòng)物模型時(shí)所調(diào)節(jié)糾正的那些物質(zhì)視為該證候的物質(zhì)基礎(chǔ)。因?yàn)檎窃摲絼┰跈C(jī)體內(nèi)發(fā)揮其藥理作用的過程中調(diào)節(jié)糾正了這些物質(zhì)后，才使該證候的臨床 癥狀得以緩解或消失。如果能找出這些物質(zhì)也就是找到了證的物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖6 各組Aminoacylase蛋白的表達(dá)

腎虛證是中醫(yī)典型的證候，中醫(yī)認(rèn)為老年生理性腎虛動(dòng)物模型一般屬腎陰、陽兩虛型，出自《景岳全書》的左歸飲和右歸飲是對(duì)老年腎虛證確有療效的經(jīng)典方劑，它們分別具有“滋陰補(bǔ)腎，填精益髓”和“溫補(bǔ)腎陽，填精益髓”的功效。本課題選用老年小鼠為腎虛證動(dòng)物模型，選用滋補(bǔ)腎陰的左歸飲和溫補(bǔ)腎陽的右歸飲為相應(yīng)方劑，對(duì)老年小鼠腎虛證動(dòng)物模型進(jìn)行干預(yù)。取各組動(dòng)物相關(guān)的組織臟器做蛋白質(zhì)雙向電泳。將青年正常組、腎虛模型組和腎虛模型給藥組動(dòng)物各組織臟器的電泳圖譜進(jìn)行分析與互相對(duì)比，找出兩方劑，將腎虛模型組與青年正常組表達(dá)差異的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)糾正為青年正常組所表達(dá)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)即為腎虛證標(biāo)志蛋白質(zhì)。本文為左歸飲干預(yù)老年小鼠腎虛證動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其調(diào)節(jié)糾正的蛋白質(zhì)應(yīng)為腎陰虛證的標(biāo)志蛋白質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腎陰虛證的標(biāo)志蛋白質(zhì)主要有分子伴侶蛋白、參與物質(zhì)代謝的蛋白質(zhì)、細(xì)胞骨架、高密度脂蛋白、未知蛋白質(zhì)等。

HSP70是熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）家族中的重要一員，是生物細(xì)胞中含量最高，誘導(dǎo)性最強(qiáng)熱休克蛋白。HSP70提高細(xì)胞對(duì)應(yīng)激源的耐受性。HSP70通過分子伴侶作用，可與細(xì)胞內(nèi)變性蛋白質(zhì)結(jié)合，促進(jìn)變性蛋白質(zhì)的修復(fù)、降解和清除。HSP70可抑制熱休克、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、單核細(xì)胞、氧化應(yīng)激等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［2］。阻斷或抑制 HSP70可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而HSP70的高表達(dá)則能抑制細(xì)胞凋亡［3，4］。HSP70 具有抗氧化作用，被譽(yù)為“細(xì)胞內(nèi)具有抗氧化能力的急性期蛋白”［5］。HSP70 可抑制白細(xì)胞介素-1（IL-1）、TNF-α等炎癥介質(zhì)的表達(dá)，抑制細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，起到非特異性免疫保護(hù)作用［6-7］。此外，HSP70在抗感染免疫、腫瘤免疫、自身免疫中也具有重要作用。本次研究結(jié)果顯示，腎陰虛證小鼠組織中HSP70顯著升高，可能是腎陰虛證狀態(tài)下，各種刺激引起機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，從而出現(xiàn) HSP70高表達(dá)，以提高機(jī)體的應(yīng)激耐受能力。而且，在孫曉敏等［8］的關(guān)于腎陰虛證研究中發(fā)現(xiàn)了HSP27異常表達(dá)，HSP70與HSP27都屬于熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）家族，這也說明熱休克蛋白與腎陰虛證的發(fā)生、發(fā)展具有密切關(guān)系。

值得注意的是，本次研究發(fā)現(xiàn)的參與物質(zhì)代謝的蛋白質(zhì)，有2個(gè)蛋白質(zhì)和我們另一個(gè)研究結(jié)果相同［9］。其中一個(gè)蛋白是 Eno1，Eno1是糖酵解中ATP合成的關(guān)鍵酶，能促使 α-磷酸甘油酸脫水向磷酸烯醇式丙酮酸的轉(zhuǎn)化，同時(shí)也在糖異生過程中催化逆向反應(yīng)［10］。Eno1存在于大多數(shù)組織內(nèi)，是糖酵解過程的限速酶，它在腎陰虛模型動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)量增加能引起糖酵解和糖異生的增多，說明腎陰虛證動(dòng)物糖代謝增強(qiáng)，這符合中醫(yī)陰虛生內(nèi)熱的理論。

另一個(gè)蛋白是氨甲酰磷酸合成酶1（carbamoylphosphate synthetase 1），氨甲酰磷酸合成酶是尿素合成的限速酶，通過水解一分子 ATP的2個(gè)高能磷酸鍵，氨甲酰磷酸合成酶催化 NH4+與 HCO3-活化并縮合形成氨甲酰磷酸，之后其進(jìn)入到鳥氨酸循環(huán)最終形成尿素。因此，氨甲酰磷酸合成酶 1表達(dá)量的減少能減慢鳥氨酸循環(huán)，由此可見腎陰虛動(dòng)物氨基酸代謝減慢，說明此時(shí)蛋白質(zhì)分解代謝降低。

Ezrin是 ERM（ezrin radixin moesin）細(xì)胞骨架連接蛋白家族的一員［11］。ERM家族最初被認(rèn)為僅僅是連接細(xì)胞膜蛋白和胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)，最近發(fā)現(xiàn)其參與了許多細(xì)胞的生理功能［12］。ERM家族蛋白參與細(xì)胞膜表面特殊結(jié)構(gòu)的組成，并且協(xié)助某些小分子物質(zhì)錨定在特定的部位［13］。Ezrin是細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的組成部分，參與了細(xì)胞與胞外基質(zhì)的黏附、細(xì)胞間的相互作用、受體酪氨酸激酶和 Rho GTPase的信號(hào)傳導(dǎo)以及 Akt介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用等［14、15］。

載脂蛋白 A-I（apolipoproteinA-I，ApoA-I）是高密度脂蛋白（HDL）的主要結(jié)構(gòu)蛋白，約占HDL總蛋白含量的70％。ApoaA-l的主要功能是抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。在脂蛋白的代謝過程中，ApoA-l維持脂蛋白的結(jié)構(gòu)和作為HDL受體的配體，還作為激活卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶（LCAT）的重要輔助因子，激活LCAT的活性，參與膽固醇的酯化。ApoA-l在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)（reverse cholesterol transport，RCT）過程中起關(guān)鍵作用，促進(jìn)組織細(xì)胞內(nèi)膽固醇的清除，避免膽固醇在外周組織中沉積［16-19］。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)了載脂蛋白 A I與機(jī)體非特異性免疫功能相關(guān)的新功能：抗內(nèi)毒素（endotxin）、調(diào)節(jié)急性相反應(yīng)（acute phase response，APR）中的中性粒細(xì)胞功能以及抗病毒［20-22］。

研究結(jié)果顯示，腎陰虛證的標(biāo)志蛋白質(zhì)還有結(jié)合蛋白，如硒結(jié)合蛋白和維生素結(jié)合蛋白。

硒結(jié)合蛋白（Selenium binding protein l，SBP-1）主要是和硒結(jié)合，而執(zhí)行調(diào)節(jié)人體免疫、抗腫瘤、抗氧化等許多重要的生理功能［23］。維生素 D結(jié)合蛋白（vitamin D binding protein，DBP）是一種可以增強(qiáng)中性粒細(xì)胞趨化活性、活化巨噬細(xì)胞的血清蛋白，并參與炎癥過程［24、25］。維生素D結(jié)合蛋白（vilamin D-bjnding prolein））主要合成于肝臟，是屬于白蛋白超家族中的一種結(jié)合蛋白［26］，其除了作為維生素 D在體內(nèi)的蛋白結(jié)合物和載體，它還具有肌動(dòng)蛋白清除功能、參與組織感染及損傷的應(yīng)答機(jī)制，加強(qiáng)補(bǔ)體C5a介導(dǎo)的趨化活性等。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)以方證相應(yīng)學(xué)說為依據(jù)，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，找到并鑒定了1組腎陰虛證標(biāo)志蛋白質(zhì)，證明用此方法探尋腎虛證的標(biāo)志蛋白質(zhì)是可行的。本文根據(jù)這些蛋白質(zhì)的功能，初步探討了腎陰虛證的發(fā)生機(jī)理，至于這些標(biāo)志蛋白質(zhì)與腎陰虛證發(fā)生機(jī)制之間更深的關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究。

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