李俊麗,李 涢,劉銘福,張 杰
(中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所,北京 100700)
本研究以中醫(yī)方證相應(yīng)學(xué)說為依據(jù),運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來探尋腎陰虛證標(biāo)志蛋白質(zhì),以求在蛋白質(zhì)表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)腎陰虛證的物質(zhì)基礎(chǔ),為證本質(zhì)的研究開辟一條新的研究途徑。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明系小鼠,雄性,購自中國中醫(yī)科學(xué)院動(dòng)物室。
1.1.2 方劑組成及處理 左歸飲:由熟地12g,山藥 6g,枸杞子 6g,炙甘草 3g,茯苓 6g,山萸肉5g組成,上述中藥冷水浸泡30min,煎煮2遍和并煎液,濃縮為 100ml,含生藥 0.38g/ml。
1.1.3 主要試劑 丙烯酰胺(Arc)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis)、三(羥甲基)氨基乙烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸胺(APS)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘代乙酰胺(IAA)、尿素均為Sigma公司產(chǎn)品;硫脲為Fluka公司產(chǎn)品;硫代硫酸鈉、無水碳酸鈉、乙醇、冰醋酸、甘氨酸均為國產(chǎn)分析純;固相 pH梯度干膠條(IPG dry strip PH3~10NL,18cm)及其 IPG緩沖液、蛋白酶抑制劑及蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)及考馬斯亮藍(lán)均購自GE公司。
1.2.1 動(dòng)物分組 昆明系雄性18月齡小鼠,隨機(jī)分為左歸飲組和老年腎虛證模型組,每組20只。左歸飲組:將左歸飲以8倍人劑量以灌胃形式給予小鼠,每日1次,每灌服6d停藥1d,連續(xù)給藥2個(gè)月。停止給藥時(shí),小鼠達(dá)20月齡。老年腎虛模型組:以同體積水灌胃小鼠,方法同給藥組。青年正常對(duì)照組:選用2月齡小鼠為青年正常對(duì)照組。
1.2.2 動(dòng)物取材及蛋白質(zhì)提取 給藥結(jié)束后,取小鼠其血清、肝、腎、睪丸組織,置于-80℃保存?zhèn)溆?。蛋白質(zhì)提?。悍謩e快速取各組小鼠肝、腎、睪丸組織約150mg,于液氮中迅速研磨。研磨后轉(zhuǎn)入eppendorf管中,加入 0.5ml組織裂解液((Tris(40mM),尿素(7M),硫脲(2M),4%CHAPS(兩性離子去污劑),1%二硫蘇糖醇,乙二胺四乙酸二鈉(1mM))。同時(shí)加入 1 ×Cocktail(混合物)蛋白酶抑制劑。將含裂解液的eppendorf埋入冰中,超聲破碎,3~4s/次,間隔 10s左右,至溶液透明。加入DNase I(10μ /μl)、RNase A(10μ /μl)各 5μl,4℃ 靜置 30min。4℃14000r/min,離心 30min。血清去高峰度蛋白處理:選用德國 QIAGEN生產(chǎn)的 Albumin and IgG Depletion試劑盒處理血清高峰度蛋白。取少量上清用 Bradford法測定蛋白濃度,其余上清-80℃保存。
1.2.3 雙向凝膠電泳 第一向等電聚焦(IEF):使用 pH3~10NL,18cm IPG預(yù)制膠條,在IPG 持膠槽中加入 7μL DTT(1M),1.75μL IPG 緩沖液(pH3~10),組織蛋白提取物(含500μg蛋白),最后加入重泡脹液(8M尿素,4%CHAPS),使總體積為350μL。將IPG膠條置入持膠槽中于聚焦儀上進(jìn)行等電聚焦電泳。電泳條件為:重泡脹(不加電壓)1h;30V電壓 10h;500V、2000V、5000V電壓各30min;最后穩(wěn)定在8000V下進(jìn)行,總電壓時(shí)間積為8萬 Vh。
第二向SDS-PAGE使用自制凝膠在Ettan DALT six Electrophoresis Unit上進(jìn)行電泳。第一向聚焦后的膠條,分別在平衡A液(1mM DTT,50mM Tris pH 8.8 ,6mM 尿素,30% 甘油,2%SDS ,0.002% 溴酚蘭)與平衡 B液(2.5%碘乙酰胺,50mMTris pH 8.8 ,6mM 尿素,30% 甘油,2%SDS,0.002% 溴酚蘭)中各平衡15min。將平衡后的 IPG膠條轉(zhuǎn)移至13%的聚丙烯酰胺凝膠上端,使IPG膠條與凝膠上端緊密貼合,在一端加入凝膠電泳蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。電泳條件為:每膠20mA 40min后再以每膠30mA電泳,直至溴酚蘭指示線到達(dá)凝膠底邊處停止電泳。
1.2.4 考馬斯亮藍(lán)染色 電泳結(jié)束后取出膠版,考馬斯亮藍(lán) R-350染色液(0.1%)染色1h,考馬斯亮藍(lán)脫色液(7%乙酸5%甲醇)12h。
1.2.5 凝膠圖像分析 凝膠通過 UMAX Power Look 2100XL掃描,凝膠數(shù)據(jù)儲(chǔ)存,采用 Image Master 2D Platinum 6.0軟件進(jìn)行凝膠的蛋白點(diǎn)檢測、背景消減及匹配,配合人工校正等方法,以保證其過程的準(zhǔn)確性。
1.2.6 質(zhì)譜鑒定 切取目的蛋白質(zhì)點(diǎn)送北京華大蛋白質(zhì)組研發(fā)中心,由MALDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析,獲取蛋白樣品的肽質(zhì)量指紋圖,最后應(yīng)用Mascot軟件在人類蛋白質(zhì)公共數(shù)據(jù)庫(NCBI)中搜尋,獲得蛋白質(zhì)的相關(guān)信息。
1.2.7 Western blot驗(yàn)證腎臟標(biāo)志蛋白表達(dá)提取小鼠腎組織總蛋白,用 Braford法檢測蛋白含量,使用 BIO RAD Mini-PROTEAN凝膠電泳儀,樣品濃度為30ug,電泳 1.5 h后取膠,用 BIO RAD轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行濕轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)膜時(shí)濾紙、PVDF膜、膠的位置為:濾紙-膠-PVDF膜-濾紙;轉(zhuǎn)膜條件:14 V 10℃冰柜過夜。轉(zhuǎn)完后放入 Tris-NaCl中清洗10 min轉(zhuǎn)入5%脫脂奶粉中封閉2 h,用PBST洗滌3次,每次10 min,孵一抗室溫 2 h,取出后 PBST洗滌 3次,每次10 min,孵二抗室溫 2 h,PBST洗滌 3次,每次 10 min。然后,在 PVDF膜上加入 ECL Plus底物溶液,用 Image Quant 400凝膠成像儀測化學(xué)發(fā)光。
2.1 雙向凝膠電泳與圖像分析結(jié)果 經(jīng)Image Master 2D Platinum 6.0軟件分析,在相同條件下識(shí)別的蛋白質(zhì)點(diǎn)個(gè)數(shù)肝組織為1484±32個(gè),腎組織為1301±28個(gè),血清為 318±34個(gè),睪丸組織為1027±21個(gè)。根據(jù)3倍差異表達(dá)做為標(biāo)準(zhǔn),共檢測出左歸飲將腎陰虛模型組非正常表達(dá)的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)糾正為正常表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)為23個(gè),圖1為各組織蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜,圖2為肝組織中異常表達(dá)蛋白質(zhì)各組比較。
2.2 差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定結(jié)果
對(duì)24個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行酶解、質(zhì)譜分析得到PMF圖譜后,查詢 NCBInr 20100928數(shù)據(jù)庫,其中4個(gè)點(diǎn)由于數(shù)據(jù)搜索蛋白的分?jǐn)?shù)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義而未得到鑒定,因此20個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)得到鑒定(結(jié)果如表1)。圖3為5號(hào)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜,檢索 NCBInr20100928數(shù)據(jù)庫顯示為apolipoprotein A-I,圖4為5號(hào)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的分?jǐn)?shù)直方圖,直方圖顯示5號(hào)蛋白質(zhì) apolipoprotein A-I的得分為93分。
圖1 各組織蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜
2.3 Western blot驗(yàn)證肝臟 Arginase-1蛋白和腎臟 Aminoacylase蛋白表達(dá)結(jié)果
Arginase-1蛋白在各組小鼠中均有表達(dá),在老年腎虛模型組表達(dá)水平較低,明顯低于青年正常對(duì)照組和左歸飲組,說明老年腎虛證小鼠體內(nèi)Arginase-1蛋白表達(dá)較低,經(jīng)左歸飲調(diào)節(jié)后其表達(dá)恢復(fù)正常,這與凝膠分析和質(zhì)譜分析結(jié)果相符(圖5)。Aminoacylase蛋白在各組小鼠中均有表達(dá),在老年腎虛模型組表達(dá)水平較低,明顯低于青年正常對(duì)照組和左歸飲組,說明老年腎虛證小鼠體內(nèi)Arginase-1蛋白表達(dá)較低,經(jīng)左歸飲調(diào)節(jié)后其表達(dá)恢復(fù)正常,這與凝膠分析和質(zhì)譜分析結(jié)果相符(圖6)
圖2 左歸飲將腎陰虛模型組肝組織中非正常表達(dá)的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)糾正為正常表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)
表1 腎陰虛證小鼠蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果及其表達(dá)變化情況
圖3 5號(hào)差異蛋白質(zhì)apolipoprotein A-I的肽質(zhì)量指紋圖譜
圖4 5號(hào)差異蛋白質(zhì)apolipoprotein A-I的分?jǐn)?shù)直方圖
圖5 各組Arginase-1蛋白的表達(dá)
方證相應(yīng)學(xué)說是對(duì)方劑與證候兩者間關(guān)系的一種闡述。方證相應(yīng)指的是一個(gè)方劑的功效和方劑內(nèi)的藥味及其配伍與其所對(duì)應(yīng)的證之間存在著高度的統(tǒng)一性和針對(duì)性[1]。方證相應(yīng)強(qiáng)調(diào)方與證的對(duì)應(yīng),有是證用是方,方為證立,方隨證轉(zhuǎn)。方證相應(yīng)才是有效方,不對(duì)應(yīng)就是無效方。中醫(yī)經(jīng)過長期的臨床實(shí)踐,逐漸認(rèn)識(shí)和確立了一些典型的證候,在臨床選藥組方治療這些證候時(shí),經(jīng)長期的反復(fù)驗(yàn)證,形成了一批對(duì)這些證候確有療效的經(jīng)典方劑。這些方劑配伍嚴(yán)謹(jǐn),指征明確,只要對(duì)證用藥,臨床療效比較肯定。這些方,后世稱之為“經(jīng)方”、“古方”,這些典型的證候和對(duì)這些證候確有療效的經(jīng)典方劑被認(rèn)為達(dá)到了方與證的相應(yīng),是公認(rèn)的有效方。在此基礎(chǔ)上,我們設(shè)計(jì)出了探尋證候物質(zhì)基礎(chǔ)的新方法:將某一方劑在治療相應(yīng)證候的患者或動(dòng)物模型時(shí)所調(diào)節(jié)糾正的那些物質(zhì)視為該證候的物質(zhì)基礎(chǔ)。因?yàn)檎窃摲絼┰跈C(jī)體內(nèi)發(fā)揮其藥理作用的過程中調(diào)節(jié)糾正了這些物質(zhì)后,才使該證候的臨床 癥狀得以緩解或消失。如果能找出這些物質(zhì)也就是找到了證的物質(zhì)基礎(chǔ)。
圖6 各組Aminoacylase蛋白的表達(dá)
腎虛證是中醫(yī)典型的證候,中醫(yī)認(rèn)為老年生理性腎虛動(dòng)物模型一般屬腎陰、陽兩虛型,出自《景岳全書》的左歸飲和右歸飲是對(duì)老年腎虛證確有療效的經(jīng)典方劑,它們分別具有“滋陰補(bǔ)腎,填精益髓”和“溫補(bǔ)腎陽,填精益髓”的功效。本課題選用老年小鼠為腎虛證動(dòng)物模型,選用滋補(bǔ)腎陰的左歸飲和溫補(bǔ)腎陽的右歸飲為相應(yīng)方劑,對(duì)老年小鼠腎虛證動(dòng)物模型進(jìn)行干預(yù)。取各組動(dòng)物相關(guān)的組織臟器做蛋白質(zhì)雙向電泳。將青年正常組、腎虛模型組和腎虛模型給藥組動(dòng)物各組織臟器的電泳圖譜進(jìn)行分析與互相對(duì)比,找出兩方劑,將腎虛模型組與青年正常組表達(dá)差異的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)糾正為青年正常組所表達(dá)的蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)即為腎虛證標(biāo)志蛋白質(zhì)。本文為左歸飲干預(yù)老年小鼠腎虛證動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,其調(diào)節(jié)糾正的蛋白質(zhì)應(yīng)為腎陰虛證的標(biāo)志蛋白質(zhì)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,腎陰虛證的標(biāo)志蛋白質(zhì)主要有分子伴侶蛋白、參與物質(zhì)代謝的蛋白質(zhì)、細(xì)胞骨架、高密度脂蛋白、未知蛋白質(zhì)等。
HSP70是熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)家族中的重要一員,是生物細(xì)胞中含量最高,誘導(dǎo)性最強(qiáng)熱休克蛋白。HSP70提高細(xì)胞對(duì)應(yīng)激源的耐受性。HSP70通過分子伴侶作用,可與細(xì)胞內(nèi)變性蛋白質(zhì)結(jié)合,促進(jìn)變性蛋白質(zhì)的修復(fù)、降解和清除。HSP70可抑制熱休克、腫瘤壞死因子 α(TNF-α)、單核細(xì)胞、氧化應(yīng)激等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[2]。阻斷或抑制 HSP70可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而HSP70的高表達(dá)則能抑制細(xì)胞凋亡[3,4]。HSP70 具有抗氧化作用,被譽(yù)為“細(xì)胞內(nèi)具有抗氧化能力的急性期蛋白”[5]。HSP70 可抑制白細(xì)胞介素-1(IL-1)、TNF-α等炎癥介質(zhì)的表達(dá),抑制細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng),起到非特異性免疫保護(hù)作用[6-7]。此外,HSP70在抗感染免疫、腫瘤免疫、自身免疫中也具有重要作用。本次研究結(jié)果顯示,腎陰虛證小鼠組織中HSP70顯著升高,可能是腎陰虛證狀態(tài)下,各種刺激引起機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng),從而出現(xiàn) HSP70高表達(dá),以提高機(jī)體的應(yīng)激耐受能力。而且,在孫曉敏等[8]的關(guān)于腎陰虛證研究中發(fā)現(xiàn)了HSP27異常表達(dá),HSP70與HSP27都屬于熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)家族,這也說明熱休克蛋白與腎陰虛證的發(fā)生、發(fā)展具有密切關(guān)系。
值得注意的是,本次研究發(fā)現(xiàn)的參與物質(zhì)代謝的蛋白質(zhì),有2個(gè)蛋白質(zhì)和我們另一個(gè)研究結(jié)果相同[9]。其中一個(gè)蛋白是 Eno1,Eno1是糖酵解中ATP合成的關(guān)鍵酶,能促使 α-磷酸甘油酸脫水向磷酸烯醇式丙酮酸的轉(zhuǎn)化,同時(shí)也在糖異生過程中催化逆向反應(yīng)[10]。Eno1存在于大多數(shù)組織內(nèi),是糖酵解過程的限速酶,它在腎陰虛模型動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)量增加能引起糖酵解和糖異生的增多,說明腎陰虛證動(dòng)物糖代謝增強(qiáng),這符合中醫(yī)陰虛生內(nèi)熱的理論。
另一個(gè)蛋白是氨甲酰磷酸合成酶1(carbamoylphosphate synthetase 1),氨甲酰磷酸合成酶是尿素合成的限速酶,通過水解一分子 ATP的2個(gè)高能磷酸鍵,氨甲酰磷酸合成酶催化 NH4+與 HCO3-活化并縮合形成氨甲酰磷酸,之后其進(jìn)入到鳥氨酸循環(huán)最終形成尿素。因此,氨甲酰磷酸合成酶 1表達(dá)量的減少能減慢鳥氨酸循環(huán),由此可見腎陰虛動(dòng)物氨基酸代謝減慢,說明此時(shí)蛋白質(zhì)分解代謝降低。
Ezrin是 ERM(ezrin radixin moesin)細(xì)胞骨架連接蛋白家族的一員[11]。ERM家族最初被認(rèn)為僅僅是連接細(xì)胞膜蛋白和胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu),最近發(fā)現(xiàn)其參與了許多細(xì)胞的生理功能[12]。ERM家族蛋白參與細(xì)胞膜表面特殊結(jié)構(gòu)的組成,并且協(xié)助某些小分子物質(zhì)錨定在特定的部位[13]。Ezrin是細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的組成部分,參與了細(xì)胞與胞外基質(zhì)的黏附、細(xì)胞間的相互作用、受體酪氨酸激酶和 Rho GTPase的信號(hào)傳導(dǎo)以及 Akt介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用等[14、15]。
載脂蛋白 A-I(apolipoproteinA-I,ApoA-I)是高密度脂蛋白(HDL)的主要結(jié)構(gòu)蛋白,約占HDL總蛋白含量的70%。ApoaA-l的主要功能是抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。在脂蛋白的代謝過程中,ApoA-l維持脂蛋白的結(jié)構(gòu)和作為HDL受體的配體,還作為激活卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(LCAT)的重要輔助因子,激活LCAT的活性,參與膽固醇的酯化。ApoA-l在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport,RCT)過程中起關(guān)鍵作用,促進(jìn)組織細(xì)胞內(nèi)膽固醇的清除,避免膽固醇在外周組織中沉積[16-19]。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)了載脂蛋白 A I與機(jī)體非特異性免疫功能相關(guān)的新功能:抗內(nèi)毒素(endotxin)、調(diào)節(jié)急性相反應(yīng)(acute phase response,APR)中的中性粒細(xì)胞功能以及抗病毒[20-22]。
研究結(jié)果顯示,腎陰虛證的標(biāo)志蛋白質(zhì)還有結(jié)合蛋白,如硒結(jié)合蛋白和維生素結(jié)合蛋白。
硒結(jié)合蛋白(Selenium binding protein l,SBP-1)主要是和硒結(jié)合,而執(zhí)行調(diào)節(jié)人體免疫、抗腫瘤、抗氧化等許多重要的生理功能[23]。維生素 D結(jié)合蛋白(vitamin D binding protein,DBP)是一種可以增強(qiáng)中性粒細(xì)胞趨化活性、活化巨噬細(xì)胞的血清蛋白,并參與炎癥過程[24、25]。維生素D結(jié)合蛋白(vilamin D-bjnding prolein))主要合成于肝臟,是屬于白蛋白超家族中的一種結(jié)合蛋白[26],其除了作為維生素 D在體內(nèi)的蛋白結(jié)合物和載體,它還具有肌動(dòng)蛋白清除功能、參與組織感染及損傷的應(yīng)答機(jī)制,加強(qiáng)補(bǔ)體C5a介導(dǎo)的趨化活性等。
綜上所述,本實(shí)驗(yàn)以方證相應(yīng)學(xué)說為依據(jù),應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù),找到并鑒定了1組腎陰虛證標(biāo)志蛋白質(zhì),證明用此方法探尋腎虛證的標(biāo)志蛋白質(zhì)是可行的。本文根據(jù)這些蛋白質(zhì)的功能,初步探討了腎陰虛證的發(fā)生機(jī)理,至于這些標(biāo)志蛋白質(zhì)與腎陰虛證發(fā)生機(jī)制之間更深的關(guān)系,還有待進(jìn)一步研究。
[1]金海浩.中醫(yī)學(xué)的方證相應(yīng)論[J].黑龍江中醫(yī)藥,2005,(1):44-46.
[2]Mosser DD,Caron AW,Bourget L,et al. Role of the human heat shock protein hsp70 in protection against stress-induced apoptosis[J].Mol Cell Biol,1997,17:5317-5327.
[3]Caminsi A,Diez-fernandez C,Prieto P.Cell Expression of Heat Shock Proteins in Dog Neutrophils after Oxidative Stress [J].Toxicology in Vitro,1999,13:437-443.
[4]Oehler R,Pusch E,Zellner M,et al.Cell lype-pecific variations in the induction of hsp70 in human leukocytes by fever like whole body hyperthermia[J].Cell Strewss Chaperones,2001,6:306-315.
[5]Polla BS.A role for heat shock protein in inflammation?[J].Immunol Today,1988,9(5):134-137.
[6]Multhoff G.Heat shock proteins in immunity[J].Handb Exp Phar-macol,2006,172.279-304.
[7]Wang HR,Ryan M,Mestri R.The heat shock response inhibits inducible nitric oxide synthase gene expression by blocking I-κB degradation and NF-κΒnucleartranslocation [J]. Biochem Biophs Res Comon,1997,231(2):257-263.
[8]孫曉敏,李曉勇,羅仁等.亞健康腎陰虛證的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究[J].四川中醫(yī),2008,26(4):7-9.
[9]李俊麗,李 涢,劉銘福,等.左歸飲與腎陰虛證方證相應(yīng)機(jī)理的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[J].中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2010,16(3):203-205.
[10]Pancholi V.Multifunctional a-enolase:its role in diseases [J].CMLS ,2001,58(7):902-920.
[11]Bretscher A,Edwards K,F(xiàn)ehon RG.ERM proteins and merlin:integrators at the cell codex[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2002,3(8):586-599.
[12]Louvet-Vallee S.ERM proteins:from cellular architecture to cell signaling[J].Biol Cell,2000,92(5):305-3 1 6.
[13]McClatchey AI.Merlin and ERM proteins:unappreciated roles in cancerdevelopment?[J]. Nat Rev Cancer,2003;3(11):877-883.
[14]Martin TA,Harrison G,Mansel RE,et al.The role of the CD44/ezrincomplex in cancer metastasis[J]. Crit Rev Oncol Hematol,2003,46(2):165-186.
[15]Gautreau A,Poullet P, Louvard D, et al. Ezrin, a plasmamembrane—microfilamentlinker,signals cellsurvival through thephosphatirtylinositol 3-kinase/Akt pathway[J]. Proc Natl Acad Sci,1999,96(2):7300-7305.
[16]Do HQ,Nazih H,Luc 13I et al. Influence of cholesteryl ester transfer protein,peroxisome proliferator-activated receptor alpha,apolipoprotein E,and apolipoprotein A-I polymorphisms on highdensity lipoprotein cholesterol,apolipoprotein A-I,lipoprotein AI,and lipoprotein A-I,A-IIconcentrations:the Prospective Epidemiological Study ofMyocardialInfarction study[J].Metabolism,2009,58(3):283-289.
[17]Eriksson M,Carlson L A,Miettinen T A,Angelin B. Stimulation offecal steroid excretion after infusion of recombinant proapolipoprotein A-I[J].Circulation,1999,100(6):594-598.
[18]Francis G A,Tsujita M,Terry T L.Apolipoprotein A efficiently binds to and mediates cholest erol and phosphol ipid efflux from human but not rat aortic smooth muscle cell[J]. Bi ochemistry,1999,38(49):16315-16322.
[19]Nanjee M N,Cooke C J,Garvin R, MillerN E. Intravenous apoA-I/lecithin discs increase prebeta-HDL concentrat ion in tissue fluid and stimulate reverse cholest erol transport in humans[J].Lipid Res,2001,42(10):1586-1593.
[20]張 寰,雯滿平,樓 濱,等.高密度脂蛋白的抗內(nèi)毒素作用[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2003,30(5):474-476.
[21]Furlaneto CJ,Ribeiro FP,Hatanaka E,Souza GM,Cassatelia MA,Campa A. ApolipopmteinsA-I and A-I downregulate neutrophit functions[J].Lipids,2002,37(9):925-927.
[22]Silbum McPhee DA,Maerz AL,Poumbourios P,Whittaker RG,et al.Efficacy of fusion peptide homologs in blocking cell lysis antiinduced fusion [J].AIDS Res Hum Relloviruses,1998,14(5):385-387.
[23]夏弈明.硒的研究進(jìn)展概況[C].中華醫(yī)學(xué)(國際學(xué)術(shù)討論會(huì)論文匯編),1993,24.27
[24]Trujillo G Kew RR. Platelet-derived thrombospondin-1 is necessary for the vitamin D-binding protein(Gc-globulin)to function as a chemotactic cofactor for C5a[J].Immuno,2004,173:4130-4136.
[25]Gumireddy K,Damodar C,Swamy N,et al. Mitogen-activated protein kinase pathway mediates DBP-maf-induced apoptosis in RAW 264.7 macrophages[J].Cell.Biochem,2003,90(1):87-96.
[26]WhIle P,COOke N. The mull. funcliOnaI properfies and characlerislicsofViIamin D-binding prolein[J]. Trends Endocrinol Melab 2000:11:320-327.