李巧汶 李志樑 邱 健 傅 強(qiáng) (南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 50282)

目前認(rèn)為，易損斑塊(VP)潰瘍、破裂、血栓形成是急性冠脈綜合征(ACS)發(fā)生的主要病理生理過程。炎癥是VP形成的最重要的機(jī)制之一，白介素-18(IL-18)作為在炎癥反應(yīng)系統(tǒng)中發(fā)揮中心性作用的炎癥因子，不但與動脈粥樣硬化(AS)斑塊的發(fā)生、發(fā)展〔1，2〕，且參可能與 VP 的形成〔1，3〕，但 IL-18 促 VP 形成的機(jī)制尚不清楚。研究表明〔4，5〕，IL-18可誘導(dǎo)多種細(xì)胞發(fā)生凋亡，而斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡是VP的重要特征之一。由此推測IL-18可能通過誘導(dǎo)斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡促進(jìn)VP的形成，但相關(guān)的證據(jù)缺乏。本研究通過IL-18刺激離體AS斑塊，觀察斑塊內(nèi)的細(xì)胞凋亡指數(shù)及形態(tài)特征，旨在探索IL-18促進(jìn)VP形成的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動脈粥樣硬化模型的制備 30只老年健康雄性新西蘭白兔，均為3月齡，平均體重2.2 kg，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號0055273。新西蘭白兔予適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后給予高脂飼料(內(nèi)含1.5%的膽固醇、5%豬油和0.5%的膽鹽)10 w，食物和水根據(jù)動物的需求供給。10 w后，注射過量的戊巴比妥處死動物。解剖動物，暴露動物的腹主動脈，清除附著于動脈上的脂肪與組織，根據(jù)斑塊的分布把腹主動脈切割成60個血管塊，上述操作嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作的原則。

1.2 離體標(biāo)本分組及處理 采用析因設(shè)計(jì)，給予2種處理因素(4種刺激時間和3種刺激濃度)，以刺激時間和刺激濃度的不同組合作為新處理組，將60個動脈粥樣硬化斑塊標(biāo)本隨機(jī)分入新處理組中(n=5)。把標(biāo)本孵育在含血清的Ham's F10培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組除培養(yǎng)基外分別加入250、50 μg/L兩種濃度的兔IL-18分別刺激0、1 d、4 d、7 d;對照組孵育在含血清的Ham's F10培養(yǎng)基0、1 d、4 d、7 d。所有標(biāo)本待培養(yǎng)基顏色變?yōu)槌赛S色時更換培養(yǎng)基，上述操作嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作的原則。

1.3 標(biāo)本大體染色及組織學(xué)特點(diǎn)的測量 經(jīng)上述處理后，甲醛固定標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋、切片，組織HE染色。使用Image-Pro Plus圖像分析軟件采集分析圖像，每個斑塊至少取10處測量纖維帽厚度取平均值，測量處包括最厚與最薄處，測量每個斑塊纖維帽厚度與脂核橫截面厚度的比值。

1.4 斑塊細(xì)胞凋亡檢測 采用原位凋亡試劑盒TUNEL法檢測。每張切片隨機(jī)觀察5個高倍視野(×400)，共計(jì)數(shù)300個細(xì)胞，計(jì)算TUNEL染色陽性的細(xì)胞所占百分比(凋亡指數(shù))。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用±s表示，析因方差分析多因素各組數(shù)據(jù)間均數(shù)的差異，線性相關(guān)分析法分析兩個變量間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 不同IL-18刺激時間和濃度斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化AS斑塊內(nèi)的細(xì)胞凋亡指數(shù)隨IL-18刺激的時間和濃度的改變而變化(P＜0.01)。隨著IL-18刺激時間的延長、刺激濃度的升高，斑塊內(nèi)的細(xì)胞凋亡指數(shù)有上升趨勢(P＜0.01)。見表 1，圖 1。

2.2 不同IL-18刺激時間和濃度斑塊帽/核比值的變化 AS斑塊的帽/核比值隨IL-18刺激的時間和濃度的改變而變化(P＜0.01)。隨著IL-18刺激時間的延長、刺激濃度的升高，斑塊的帽/核比值有下降趨勢(P＜0.01)。見表2。

2.3 斑塊細(xì)胞的凋亡指數(shù)與帽/核比值的相關(guān)性分析 對斑塊細(xì)胞的凋亡指數(shù)與帽/核比值進(jìn)行線性相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，斑塊細(xì)胞的凋亡指數(shù)與帽/核比值呈顯著線性負(fù)相關(guān)(r=－0.776，P ＜0.001)。

表1 不同IL-18刺激時間和濃度斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化(±s，析因分析，n=5)

表1 不同IL-18刺激時間和濃度斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化(±s，析因分析，n=5)

?主效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值，下表同

?

表2 不同IL-18刺激時間和濃度時斑塊帽/核比值的變化(±s，析因分析，n=5)

表2 不同IL-18刺激時間和濃度時斑塊帽/核比值的變化(±s，析因分析，n=5)

?

圖1 不同斑塊中的凋亡細(xì)胞(箭頭所示，×400)

3 討論

ACS是以冠狀A(yù)S斑塊侵蝕或破裂繼發(fā)的完全或不完全閉塞性血栓形成為病理基礎(chǔ)的一組臨床綜合征，包括不穩(wěn)定型心絞痛、ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死。一般認(rèn)為，引起ACS發(fā)生的主要病理生理過程為VP的潰瘍、破裂、血栓的形成。炎癥反應(yīng)與VP的形成密切相關(guān)，炎癥可通過斑塊內(nèi)的炎癥細(xì)胞及其分泌的促炎癥因子使斑塊的纖維帽變薄、脂核變大，導(dǎo)致VP表型的形成。IL-18是一種新近發(fā)現(xiàn)的在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的促炎癥介質(zhì)，研究表明〔1～3〕，IL-18參與了AS斑塊的形成、進(jìn)展乃至VP形成的整個過程。臨床資料也〔6〕顯示，ACS患者血漿IL-18的水平顯著升高，提示IL-18與VP的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而，IL-18促VP發(fā)生發(fā)展的機(jī)制目前尚不清楚，本研究通過IL-18對離體AS斑塊的刺激，觀察IL-18對AS斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡指數(shù)以及AS斑塊形態(tài)特征的影響，以探索IL-18促VP發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，AS斑塊內(nèi)的細(xì)胞凋亡指數(shù)隨IL-18刺激的時間和濃度的改變而變化，隨著IL-18刺激時間的延長、刺激濃度的升高，斑塊內(nèi)的細(xì)胞凋亡指數(shù)有上升趨勢。AS斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡增加可增大斑塊內(nèi)的壞死中心，促使纖維帽變薄，導(dǎo)致VP表型的形成，因此，斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡是VP的主要特征之一。本研究結(jié)果提示，IL-18可能通過誘導(dǎo)斑塊內(nèi)的細(xì)胞凋亡促進(jìn)VP的形成。IL-18誘導(dǎo)斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡的可能途徑包括:①IL-18能通過刺激機(jī)體釋放多種促炎癥介質(zhì)(TNF、IL-1β、IL-6、iNOS)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔5〕。②IL-18 本身可直接激活外源性凋亡通路和內(nèi)源性線粒體凋亡通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。IL-18一方面可通過誘導(dǎo)TNF的產(chǎn)生、上調(diào)NK細(xì)胞和Th1細(xì)胞的Fas-L表達(dá)、增強(qiáng)的Fas-L型介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性激活外源性凋亡通路〔7，8〕，另一方面，IL-18還可促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C從線粒體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)而激活內(nèi)源性線粒體凋亡通路〔9〕。

從AS斑塊標(biāo)本的形態(tài)特征進(jìn)行分析，結(jié)果表明，AS斑塊的帽/核比值隨IL-18刺激的時間和濃度的改變而變化，隨著IL-18刺激時間的延長、刺激濃度的升高，斑塊的帽/核比值有下降趨勢，引起斑塊趨于VP的形態(tài)特征。另外，斑塊內(nèi)細(xì)胞的凋亡指數(shù)與帽/核比值的線性相關(guān)性分析顯示，斑塊內(nèi)細(xì)胞的凋亡指數(shù)與帽/核比值呈顯著線性負(fù)相關(guān)，提示斑塊內(nèi)的凋亡細(xì)胞增加促進(jìn)VP形態(tài)特征的形成。斑塊內(nèi)的細(xì)胞凋亡增加導(dǎo)致VP形成的可能機(jī)制包括:① 細(xì)胞凋亡后，一方面可釋放膽固醇，使AS斑塊核心形成、擴(kuò)大，損傷纖維帽，另一方面，釋放蛋白酶和少量炎性因子，刺激巨噬細(xì)胞分泌基質(zhì)降解蛋白酶，損傷纖維帽，致纖維帽變薄〔10〕，加速VP的形成;②凋亡細(xì)胞 (巨噬細(xì)胞)被吞噬清除過程中，可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)AS斑塊不穩(wěn)定〔11〕。③巨噬細(xì)胞凋亡后，其數(shù)目減少，致使凋亡的平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等不能被有效吞噬，促進(jìn)AS斑塊內(nèi)脂質(zhì)核心形成和擴(kuò)大，使纖維帽易于破裂;④細(xì)胞凋亡后可釋放促血栓形成物質(zhì) (如組織因子等)〔12〕，促進(jìn)血栓的形成。

可見，隨著隨著IL-18刺激時間的延長、刺激濃度的升高，斑塊內(nèi)的細(xì)胞凋亡指數(shù)有上升趨勢，相反，斑塊的帽/核比值有下降趨勢，而斑塊內(nèi)的細(xì)胞凋亡指數(shù)和斑塊的帽/核比值也呈顯著負(fù)相關(guān)，這就提示了IL-18通過誘導(dǎo)斑塊內(nèi)的細(xì)胞凋亡可能是促進(jìn)VP形成的重要機(jī)制。在臨床中，檢測血漿IL-18的濃度對VP診斷有一定的臨床意義，目前，已有不少學(xué)者〔13，14〕提出通過檢測AS斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡以診斷VP;在VP的防治中，抑制IL-18的生物學(xué)效應(yīng)及細(xì)胞凋亡將可能成為預(yù)防VP形成的重要手段。

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