徐 俊,包振民,任曉亮,王 珊,胡麗萍,黃曉婷＊＊

(1.中國海洋大學海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室,山東青島266003;2.上海市醫(yī)藥學校,上海200135)

櫛孔扇貝DAPI帶型和PI帶型研究

徐 俊1,2,包振民1,任曉亮1,王 珊1,胡麗萍1,黃曉婷1＊＊

(1.中國海洋大學海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室,山東青島266003;2.上海市醫(yī)藥學校,上海200135)

選取櫛孔扇貝Chlamys f arreri擔輪幼蟲為材料,采用秋水仙素-低滲-空氣干燥法制備染色體標本,應用熒光顯帶技術,分析了DAPI帶和PI帶在櫛孔扇貝染色體上的分布。DAPI帶型結果顯示,櫛孔扇貝所有染色體上都存在DAPI陽性帶,主要分布于傳統(tǒng)的著絲粒區(qū)和端部區(qū)域,另外還存在一些中間區(qū)DAPI帶及可變帶,總帶數為62。PI帶型結果與DAPI帶型結果相似,在所有染色體上都存在PI陽性帶。2種帶型的陽性帶所在位置與異染色質分布區(qū)域相吻合。

櫛孔扇貝(Chlamys f arreri);染色體;DAPI帶;PI帶

櫛孔扇貝Chlamys f arreri(Jones et Preston, 1904)隸屬于軟體動物門Mollusca雙殼綱Bivalvia翼形亞綱Pterimorphia珍珠貝目Pterioida扇貝科Pectinidae。自然分布于我國遼寧和山東沿海,朝鮮和日本沿海[1],是我國重要的海水養(yǎng)殖貝類。

櫛孔扇貝染色體核型分析結果表明,其染色體長度基本呈連續(xù)性分布,除3對典型的中部著絲粒染色體外,其余均為亞中部和亞端部著絲粒染色體[2],單純從形態(tài)上不易進行染色體的準確區(qū)分與配對。帶型是對染色體形態(tài)結構進行精細分析的研究,有了顯帶技術,不僅能更準確地進行同源染色體的配對和核型排列[3],而且能精確的辨認染色體的結構變化,并能正確的識別特定的染色體以及追溯標記性染色體或超數染色體的來源,探討生物種屬染色體的進化與分化等問題,提供更多的具有鑒定性特征的信息。關于貝類染色體帶型的報道,國內外文獻均不太多,這很大程度上與貝類缺乏細胞培養(yǎng)體系,難以得到高質量的染色體標本有關,以往的報道主要集中在牡蠣、貽貝、扇貝等幾種主要的經濟貝類,主要開展過G帶、C帶、Ag-NOR帶的研究,如:太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)的G帶和Ag-NOR帶[4];紫貽貝(Mytilus edulis)的G帶、C帶、Ag-NOR帶和限制性內切酶帶[5],貽貝M. edulis,M.galloprovincialis和M.trossulus的C帶、Ag-NOR帶[6];櫛孔扇貝(C.f arreri)的Ag-NOR帶[2],海灣扇貝(A rgopecten irradians)的C帶和Ag-NOR帶[7]等等。熒光染料DAPI可揭示染色體上A T富含的區(qū)域,生物細胞分裂期的前、中期的染色體相對較長,經DAPI等染料染色后染色體上會顯示明顯不同的深染區(qū)和淺染區(qū)[8],深染區(qū)和淺染區(qū)的大小和分布在不同染色體上互有差別,這可以作為識別特定染色體的重要標志,也可避免識別同源染色體的麻煩[9]。迄今為止,它已被廣泛應用于動植物的染色體研究。

本研究利用2種熒光染料DAPI和PI,對櫛孔扇貝染色體進行帶型分析,構建櫛孔扇貝染色體帶型模式圖,研究結果將豐富扇貝細胞遺傳學信息,為扇貝的遺傳育種及系統(tǒng)演化等研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

櫛孔扇貝親本取自榮成尋山集團。

1.2 方法

1.2.1 染色體制備 選取性腺飽滿、成熟度好的雌雄扇貝各10～20只,陰干刺激法[10]人工誘導使其排卵、產精后進行人工受精,待發(fā)育到擔輪幼蟲時期,用0.01%秋水仙素處理2.5 h;然后用0.075 mol/L KCl溶液低滲30 min,卡諾固定液(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1)固定3次,每次15 min,-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DAPI帶型和PI帶型 用50%的醋酸溶液解離胚胎細胞1～2 min,用氣干法制片[11]。待染色體標本自然干燥(氣干)后,加30μL PI(1.5μg/mL)或者DAPI(1.5μg/mL)染液于玻片上,染色10 min,Nikon E-600熒光顯微鏡觀察,CCD拍照,LUCIA細胞遺傳學工作站進行染色體初步配對分析。選取較好的10個以上中期分裂相,測量染色體的相對長度,計算臂比,按照Levan[12]的標準進行核型分析。

2 結果

2.1 DAPI染色觀察結果

櫛孔扇貝染色體經DAPI染色后的結果見圖1,核型數據見表1。DAPI帶型結果顯示,櫛孔扇貝染色體在傳統(tǒng)的著絲粒區(qū)(Centromeric regions)、末端區(qū)(Terminal regions)、近著絲粒區(qū)(Pericentric regions)和中間區(qū)(Interstitial regions)顯帶,陽性帶多分布在著絲粒區(qū)、端部以及近著絲粒區(qū),且端部帶的面積較大染色較深。在分析比較不同的櫛孔扇貝染色體分裂相時發(fā)現,有些部位的DAPI帶會呈現顯色的改變,有時呈陰性帶,有時呈陽性帶。經統(tǒng)計比較12個不同DAPI帶顯示的分裂相,櫛孔扇貝染色體DAPI帶模式圖如圖2所示。

DAPI帶型統(tǒng)計結果見表2:共有62條明暗帶,分為3種類型。①陽性帶,共34條帶。②陰性帶,共16條帶。③可變帶,共12條帶。按照DAPI帶所處的位置可以分為著絲粒區(qū)、近著絲粒區(qū)、中間區(qū)和端部共4個不同的區(qū)域。

圖1 櫛孔扇貝染色體DAPI帶型圖 (標尺=5μm)Fig.1 The DAPI-banding karyotype ofC.f arreri (scale bar=5μm)

表1 櫛孔扇貝染色體相對長度、臂比的統(tǒng)計結果及染色體分類Table 1 Relative length、arm ratio and chromosome type ofC.f arreri

圖2 櫛孔扇貝DAPI帶型模式圖Fig.2 Idiogram of DAPI-banding ofC.f arreri

表2 櫛孔扇貝染色體DAPI帶統(tǒng)計結果Table 2 The numbers of DAPI-bands ofC.f arreri

2.2 PI染色觀察結果

圖3為櫛孔扇貝擔輪幼蟲染色體經PI染色后的結果及核型。經PI染色后,統(tǒng)計分析15個分裂相并進行核型分析,櫛孔扇貝染色體在傳統(tǒng)的著絲粒區(qū)(Centromeric regions)、末端區(qū)(Terminal regions)、近著絲粒區(qū)(Pericentric regions)和中間區(qū)(Interstitial regions)顯帶,陽性帶多分布在著絲粒區(qū)、端部以及近著絲粒區(qū),且端部帶的面積較大染色較深。

圖3 櫛孔扇貝染色體PI帶型圖 (標尺=5μm)Fig.3 The PI-banding karyotype ofC.f arreri(scale bar=5μm)

3 討論

3.1 櫛孔扇貝DAPI帶型

熒光染料DAPI是1種雙鏈DNA特異的染料,與DNA作用至少有2種不同的機制,在A T富含區(qū),DAPI與雙鏈的小溝結合,其結合量大,發(fā)出較強的熒光;在GC富含區(qū),DAPI則插入雙鏈的DNA之間而產生較弱的熒光或不發(fā)熒光。同時由于DAPI的結合也可能影響染色體上蛋白質結構從而產生染色體帶。因此DAPI帶紋在一定程度上反映了染色體DNA的分子序列和蛋白組成[13-14]。DAPI熒光顯帶技術在染色體未經任何化學處理的情況下,直接用DAPI進行染色,利用熒光顯微鏡進行觀察分析,可以看到在染色體上展示出類似于C帶的帶紋,這種方法由于染色體未經化學處理,因此顯示的帶紋忠實地反映了染色體的結構和異染色質的分布[15]。目前國內外學者利用熒光染料DAPI已經構建了大麥[16]、蕹菜[17]等植物的染色體模式圖;動物DAPI帶型方面,在瀨魚[18]、河豚[19]、鳙魚[20]等不同類型的魚類染色體中亦有相關報道,這一技術在細胞遺傳學研究中顯示出重要的意義。

通過實驗,作者發(fā)現櫛孔扇貝的大部分染色體的著絲粒位置和端部位置出現DAPI深染帶,而且深染帶的面積很大,說明櫛孔扇貝染色體的著絲粒和端部為富含AT的區(qū)域。DAPI帶型在扇貝科3種扇貝中已有報道,在Hinnites distortus中,DAPI陽性帶主要位于著絲粒處[21];在蝦夷扇貝(Patinopecten Yessoensis)中,DAPI深染帶主要存在于著絲粒區(qū)域,而少部分存在于染色體中部[22];以上2種扇貝的DAPI帶型結果與本文的結果類似。而在海灣扇貝(A.irradians)中,DAPI陽性帶主要出現在染色體的端部和著絲粒位置,少數帶位于染色體中間位置[7]。López-Pi?nón等[21]認為DAPI帶型和C帶型結果相似,都反映的是染色體上組成型異染色質區(qū)域。在扇貝科動物中,僅有海灣扇貝(A.irradians)[7]、女王扇貝(Aequipecten opercularis)[23]和Nodipecten nodosus[24]有過應用C帶進行組成型異染色質分布的研究報道,主要定位在染色體的著絲粒,中間或端部區(qū)域,與DAPI帶型顯示的異染色質區(qū)相似。因此,作者推測櫛孔扇貝、蝦夷扇貝、女王扇貝等扇貝科物種其組成型異染色質區(qū)主要分布在染色體的著絲粒區(qū)域和部分端部區(qū)域,而海灣扇貝的組成型異染色質區(qū)則主要分布于染色體的端部區(qū)域。

3.2 櫛孔扇貝PI帶型

PI帶型技術相對于其他帶型技術而言,應用的報道少一些,在扇貝中的應用更是少見,僅見Zhang等[25]對海灣扇貝和蝦夷扇貝進行PI帶型研究,發(fā)現其結果顯示出與C帶相似的帶型。

在本文的實驗中,用熒光染料PI對櫛孔扇貝染色體進行染色,發(fā)現大部分染色體的著絲粒區(qū)域和端部區(qū)域均出現PI深染帶,全部染色體的長臂上均有陽性帶出現。在海灣扇貝中PI陽性帶主要出現在染色體的端部和著絲粒位置,少數帶位于染色體中間位置,一些位于近著絲粒位置的可變帶面積擴展到幾乎整個短臂上,顯示出在海灣扇貝短臂上分布的大量異染色質區(qū)域;而蝦夷扇貝中,PI陽性帶則集中在著絲粒區(qū)域[25]。PI陽性帶的位置可以反映不同種類扇貝染色體上組成型異染色質分布情況的差異,使用熒光染料PI對櫛孔扇貝染色體進行處理,顯示了與DAPI帶以及C帶相似的結果,表明PI帶型也可以成為核型及帶型分析中的1個新的指標。

經過20多年的發(fā)展,染色體帶型技術正在逐漸走向成熟,比如C帶,銀染帶等技術,而且它們已被廣泛地應用于哺乳動物[26]、植物[27]以及魚類[28]等染色體的研究中。在一些模式生物染色體帶型研究中,帶型技術都顯示出了較好的穩(wěn)定性和可靠性,在核型分析、染色體鑒定方面都起到了很重要的作用,正是有鑒于此,本文將帶型技術引入到扇貝染色體的研究當中,希望通過帶型分析,嘗試進行扇貝染色體的區(qū)分鑒定。通過實驗發(fā)現,櫛孔扇貝染色體的DAPI帶型以及PI帶型染色面積比較大,陰性帶與陽性帶的差異并不明顯,且存在一定數量的可變帶,穩(wěn)定性相對較低。推測其中的原因,可能是扇貝染色體結構與其他生物相比有一定差別,4種堿基的分布相對比較均勻,AT富含區(qū)或者GC富含區(qū)相對較少,因此很難出現非常清晰且穩(wěn)定的陽性帶或陰性帶。盡管可以通過染色體的大小和形態(tài)以及帶紋的多少、深淺來進一步加以辨別,但還是難以做到通過一系列處理后,能夠一目了然地把每條染色體區(qū)分開來。所以作者認為,在其他生物染色體研究中已經發(fā)展成熟的帶型技術,其方法及流程在扇貝染色體研究中還存在著可以提升與改進的地方,在本實驗室的后續(xù)工作中,作者正在將帶型技術與熒光原位雜交技術(Fluorescence in situ hybridization, FISH)結合起來,通過基因定位[2,7,22,29],提供更加清晰穩(wěn)定的染色體標記來實現扇貝染色體的區(qū)分鑒定。

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Abstract: In this paper,the techniques including DAPI-staining and PI-staining were used to study the DAPI-banding and PI-banding patterns ofChlamys f arreri.Chromosomes spread from trochophore were prepared by Colchine-hypotonic-air drying methods.The results showed that DAPI-bands displayed in all the chromosomes ofC.f arreri,and they were mostly distributed in centromeric regions and terminal regions.Some interstitial bands and variable bands were also observed.62 DAPI positive bands were recorded in 12 chromosome metaphases.In addition,PI positive bands also displayed in all the chromosomes, and their positions were similar to that of the DAPI-bands.Both the positive DAPI-bands and the positive PI-bands distributed in the heterochromatin regions ofC.f arrerichromosomes.

Key words: Zhikong scallop(Chlamys f arreri);chromosome;DAPI-banding;PI-banding

責任編輯 于 衛(wèi)

DAPI-Banding and PI-Banding of Zhikong Scallop(Chlamys farreri)

XU Jun1,2,BAO Zhen-Min1,REN Xiao-Liang1,WANG Shan1,HU Li-Ping1,HUANG Xiao-Ting1
(1.Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding,Ministry of Education,Ocean University of China,Qingdao 266003, China;2.Shanghai Pharmaceutical School,Shanghai 200135,China)

S917.4

A

1672-5174(2011)04-077-05

國家高技術研究發(fā)展計劃項目(2006AA10A408,2010AA10A401);國家自然科學青年基金項目(30901096);中國科學院實驗海洋生物學重點實驗室開放基金項目(KFN92007NO12)資助

2010-05-12;

2010-09-13

徐 俊(1979-),女,碩士,講師。E-mail:victory0086@hotmail.com

E-mail:xthuang@ouc.edu.cn