張啟春， 楊雨微， 卞慧敏

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院臨床藥理教研室，江蘇南京210029)

斑馬魚具有產(chǎn)卵多、性周期短、易于飼養(yǎng)等特點(diǎn)，其胚胎體外受精和發(fā)育，胚胎透明，便于鏡下觀察形態(tài)變化。近年來，斑馬魚作為一種模式動物越來越多地應(yīng)用于發(fā)育和毒理學(xué)研究［1-2］。但就斑馬魚在中藥研究中應(yīng)用的報(bào)道尚不多見。

馬錢子作為散血熱、消腫、止痛的藥物，具有顯著的鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、興奮中樞等作用，用于風(fēng)濕頑痹、麻木癱瘓、癰疽腫痛等癥［3-4］。馬錢子堿(brucine，B)既是馬錢子有效成分，又是毒性成分，其治療劑量和中毒劑量接近。馬錢子堿中毒主要表現(xiàn)為神經(jīng)毒性。故馬錢子多以炮制品入藥，炮制過程中馬錢子堿可轉(zhuǎn)化為馬錢子堿氮氧化物(brucine N-oxide，BN)。炮制后的氮氧化物毒性僅分別為前化合物的1/15，中毒潛伏期顯著延長［5］。

本實(shí)驗(yàn)以斑馬魚為研究對象，通過斑馬魚胚胎發(fā)育過程的觀察，評價(jià)馬錢子堿及生物轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物馬錢子堿氮氧化物對胚胎發(fā)育影響的差異，同時(shí)為中藥毒理評價(jià)嘗試一種新的方法。

1 材料

1．1 魚種的飼養(yǎng)及受精卵收集 將成年野生型A×B品系斑馬魚飼養(yǎng)在經(jīng)活性碳處理、紫外線消毒并經(jīng)充分曝氣的養(yǎng)魚用水內(nèi)。水溫保持(28±1)℃，pH 值為(8．0 ±0．3)，溶解氧量 5 ～10 mg/L，總硬度68 mg/L(以 CaCO3計(jì))，總氨量 ＜0．1mg/L。實(shí)驗(yàn)室光照-黑暗周期為14 h∶10 h。

雌魚交配后在魚卵收集器產(chǎn)生受精卵，2 h后將受精卵用虹吸管取出，用蒸餾水、培養(yǎng)液清洗魚卵以除去糞便等雜物。收得魚卵后放入魚卵孵化液中。受精卵發(fā)育6 h，解剖顯微鏡下挑選出正常的并已達(dá)到囊胚期的斑馬魚受精卵放入24孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．2 試劑與儀器 馬錢子堿，日本和光純藥株式會社;馬錢子氮氧化物，南京中醫(yī)藥大學(xué)潘揚(yáng)教授惠贈;吖啶橙，Tricaine，Sigma 公司;Hank’s液:0．137 mol/L 氯化鈉，5．4 mol/L 氯化鉀，0．25 mmol/L 磷酸氫二鈉，0．44 mmol/L 磷酸二氫鉀，1．3 mmol/L 氯化鈣，1．0 mmol/L硫酸鎂，4．2 mmol/L 碳酸氫鈉;SZX9解剖顯微鏡，正置熒光顯微鏡，OLYMPUS。

2 方法

LC50觀察:配制馬錢子堿 10 000、5 000、3 000、2 000、1 000、500、200、100 μmol/L 質(zhì)量濃度，馬錢子堿氮氧化物 20 000、10 000、5 000、2 000、1 000、500μmol/L質(zhì)量濃度。將收集的受精卵浸入上述含不同質(zhì)量濃度藥物的培養(yǎng)液中，進(jìn)行24、96 h連續(xù)培養(yǎng)。

孵化率、存活率及形態(tài)學(xué)觀察:將斑馬魚受精卵浸入含 2 000、1 000、500、200、100 μmol/L 馬錢子堿及其氮氧化物的溶液中，觀察72 h孵化率;以100 μmol/L質(zhì)量濃度觀察 24、48、72、96 與 120 h 存活率;200 μmol/L 質(zhì)量濃度下，分別觀察 24、36、48、72 h形態(tài)變化。

凋亡檢測:培養(yǎng)96 h后斑馬魚吖啶橙染色，熒光顯微鏡觀察;另培養(yǎng)24 h受精卵，胰酶消化，吸管吹散混勻，流式細(xì)胞儀檢測。

3 統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS11．5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，機(jī)率單位加權(quán)回歸法(Bliss法)法用以計(jì)算半數(shù)致死濃度(LC50)。

4 結(jié)果

4．1 馬錢子堿及其堿氮氧化物對斑馬魚胚胎及幼魚的LC5024 h馬錢子堿、馬錢子堿氮氧化物L(fēng)C50分別為 1．81、25．827 mmol/L，96 h 馬錢子堿、馬錢子堿氮氧化物 LC50分別為 0．364、3．646 mmol/L。結(jié)果表明，馬錢子堿對斑馬魚胚胎及幼魚的毒性大于馬錢子堿氮氧化物，前者LC50是后者的10～15倍(結(jié)果見表1～2)。

表1 馬錢子堿及其堿氮氧化物對斑馬魚胚胎LC50(24 h)Table．1 LC50 of brucine and brucine N-oxide tozebrafish embryos(24 h)

4．2 馬錢子堿及其堿氮氧化物對斑馬魚胚胎孵化率的影響 與對照組比較，在2 000、1 000、500、200、100μmol/L質(zhì)量濃度下，馬錢子堿組孵化率均存在明顯降低，馬錢子堿氮氧化物組孵化率均高于相應(yīng)濃度的馬錢子堿組;而馬錢子堿氮氧化物組僅在2 000、1 000、500 μmol/L質(zhì)量濃度下，與對照組(C)相比有孵化率顯著降低。馬錢子堿及其氮氧化物在較高質(zhì)量濃度2 000、1 000μmol/L孵化率間的差異存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(結(jié)果見圖1，B:馬錢子堿;BN:馬錢子堿氮氧化物;C:對照)。

圖1 馬錢子堿及其堿氮氧化物對斑馬魚胚胎孵化率的影響 ± s，n=10)Fig．1 Effect of brucine and brucine N-oxide on hatching rate of zebrafish embryo( ± s，n=10)

4．3 馬錢子堿及其堿氮氧化物對斑馬魚胚胎成活率的影響 用500μmol/L的馬錢子堿及其氮氧化物處理斑馬魚胚胎，馬錢子堿氮氧化物組斑馬魚胚胎成活率在觀察的各時(shí)間點(diǎn)均高于馬錢子堿組，其差異在24及48 h時(shí)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(結(jié)果見圖2，B:馬錢子堿;BN:馬錢子堿氮氧化物)。

圖2 馬錢子堿及其堿氮氧化物對斑馬魚胚胎成活率的影響( ± s，n=10)Fig．2 Effect of brucine and brucine N-oxide on survival rate of zebrafish embryo( ± s，n=10)

4．4 馬錢子堿及其堿氮氧化物對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響 正常組魚卵發(fā)育正常，48 h部分開始破膜，72 h已孵化成幼魚。用200μmol/L的馬錢子堿處理后的魚卵發(fā)現(xiàn)有脊柱側(cè)彎，心包水腫，黑色素少等現(xiàn)象;用相同濃度的馬錢子堿氮氧化物處理斑馬魚卵，沒有觀察到上述發(fā)育異?，F(xiàn)象。當(dāng)馬錢子堿氮氧化物濃度增加到1 000μmol/L時(shí)，有個(gè)別魚卵出現(xiàn)了脊柱側(cè)彎，心包水腫等現(xiàn)象(見圖3)。

圖3 馬錢子堿及其堿氮氧化物對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響(n=10)Fig．3 Effect of brucine and brucine N-oxide on developm ent of zebrafish em bryo(n=10)

4．5 馬錢子堿及其堿氮氧化物對斑馬魚胚胎細(xì)胞凋亡的影響 吖啶橙染色后觀察到馬錢子堿氮氧化物組斑馬魚除了眼睛晶狀體上有少量熒光表達(dá)外其它部位無明顯熒光表達(dá);馬錢子堿組斑馬魚染色后熒光表達(dá)明顯，主要表現(xiàn)在頭部(大腦、小腦)、腹部、眼睛晶狀體、視網(wǎng)膜。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，馬前子堿組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，而馬錢子堿氮氧化物組雖然與對照組比，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其顯著低于馬錢子堿組;馬錢子堿組G1、C2期細(xì)胞比例高于對照組與馬錢子堿氮氧化物組，而S期細(xì)胞比例則低于后兩者，但未觀察到組間存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖4～5，表3;B:馬錢子堿;BN:馬錢子堿氮氧化物;C:對照)。

圖4 馬錢子堿及其堿氮氧化物對斑馬魚胚胎細(xì)胞凋亡的影響(n=3)Fig．4 Effect of brucine and brucine N-oxide on apoptosis of zebrafish embryo(n=3)

表3 馬錢子堿及其堿氮氧化物對斑馬魚胚胎24 h細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響( ± s，n=3)Table．3 Effect of brucine and brucine N-oxide on apoptosis and cell cycle of zebrafish embryo( ± s，n=3)

表3 馬錢子堿及其堿氮氧化物對斑馬魚胚胎24 h細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響( ± s，n=3)Table．3 Effect of brucine and brucine N-oxide on apoptosis and cell cycle of zebrafish embryo( ± s，n=3)

與對照組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;B 與 BN 比較，##P ＜0．01。*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01 vs control group;##P ＜0．01 B vs BN．

組別 例數(shù) 劑量/(μmol/L) 凋亡率/% 細(xì)胞周期分布/%G1期 G2期 S期對照 3 － 0．11 ± 0．08 59．95 ± 1．61 7．09 ± 1．78 32．96 ± 3．32馬錢子堿 3 200 3．73 ±1．67＊＊ 71．84 ±12．92 11．79 ± 2．45 16．36 ±15．36馬錢子堿氮氧化物 3 200 0．54 ±0．19*##54．75 ± 7．71 8．78 ± 4．73 36．47 ± 10．36

圖5 馬錢子堿及其堿氮氧化物對斑馬魚胚胎24h細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響(n=3)Fig．5 Effect of brucine and brucine N-oxide on apoptosis and cell cycle of zebrafish embryo(n=3)

5 討論

斑馬魚早期胚胎發(fā)育的動態(tài)表現(xiàn)為［6］:斑馬魚受精卵為圓形，50 min左右開始卵裂，以后每15～20 min左右卵裂一次;2．5 h后胚胎進(jìn)入囊胚期，可見胚盤象一頂帽子蓋在卵黃的表面;15 h后，逐漸發(fā)育為幼魚。破膜前的幼魚頭尾相對曲臥于膠膜中，腹側(cè)“抱著”卵黃。其眼球黑色，背腹部黑色素細(xì)胞呈斑塊狀，心臟為紡錘形的囊，節(jié)律性心跳明顯，血液由心臟泵出，通過耳囊深部沿背血管流向體后，然后折轉(zhuǎn)向前腹部，向前穿過卵黃流回心臟。消化道、泄殖孔清晰可見，尾鰭寬大，耳囊呈薄膜狀，內(nèi)可見兩個(gè)黑色小圓點(diǎn);72 h后，正常發(fā)育的幼魚尾部劇烈擺動破膜先出，之后整個(gè)魚體出膜。出膜的幼魚體長約4 mm左右;1 d后常到水面游動，1周后開始捕食。但由于外界溫度條件的不同，整個(gè)胚胎的發(fā)育過程會有所差異。

斑馬魚魚卵常年可得，透明度高，發(fā)育迅速，特征明顯，便于觀察。斑馬魚的胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)與傳統(tǒng)的成魚急性毒性實(shí)驗(yàn)相比，具有成本低、影響因素少、易于重復(fù)性和靈敏度高等的特點(diǎn)，而且生命早期發(fā)育階段通常對毒性作用最敏感。胚胎毒性實(shí)驗(yàn)成為成魚急性毒性試驗(yàn)的有效替代手段［7］。不同作用機(jī)理的化合物在不同胚胎發(fā)育階段內(nèi)不僅毒性作用表征不同，且敏感度也會有所改變［8］。所以研究不同發(fā)育階段的毒性效應(yīng)可以為化合物毒理評價(jià)研究提供特殊的信息，如毒物最敏感的毒理學(xué)指標(biāo)和最關(guān)鍵的暴露時(shí)間等［9］。斑馬魚對藥物毒性作用呈現(xiàn)出與哺乳動物可比的反應(yīng)。一般藥物毒性研究包括急性單個(gè)劑量試驗(yàn)、亞慢性多個(gè)劑量組試驗(yàn)、慢性毒劑量試驗(yàn)。除了利用斑馬魚進(jìn)行了一般毒性實(shí)驗(yàn)外，還能就如血管發(fā)生、神經(jīng)毒性、肝毒性、軟骨發(fā)育、生殖毒性、發(fā)育毒性、腫瘤發(fā)生等進(jìn)行研究［10-14］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在斑馬魚胚胎期和斑馬魚幼魚期，馬錢子堿的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于馬錢子堿氮氧化物。馬錢子堿的半數(shù)致死量是馬錢子堿氮氧化物的10～15倍。對斑馬魚胚胎發(fā)育的觀察結(jié)果證實(shí)了生物轉(zhuǎn)化后的馬錢子堿氮氧化物毒性亦明顯低于馬錢子堿，與斑馬魚急性毒性實(shí)驗(yàn)一致。由此可見，斑馬魚作為一種模式動物，一種可實(shí)現(xiàn)高通量操作的脊椎動物，在中藥毒性評價(jià)上有著非常重要的意義。

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