李淑賢，梁生旺

（1.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞523808；2.廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州510006）

肝癥消膠囊是由人參、黃芪、醋鱉甲、土鱉蟲等中藥組成，本方具有益氣活血、護(hù)肝解毒、軟堅(jiān)消癥的作用，用于防治慢性肝炎向肝纖維化發(fā)展，以及肝纖維化、肝硬化的臨床治療。人參為方中君藥，近年來(lái)，有關(guān)人參文獻(xiàn)報(bào)道多采用HPLC法測(cè)定其中有效成分的含量［1－5］，為了控制本品的質(zhì)量，我們選擇高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定人參中主要化學(xué)成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb1的含量，以建立合理的含量測(cè)定指標(biāo)和限度標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與試劑

Shimadzu CLASS－VP型高效液相色譜儀（日本島津）；SPD－10Atvp紫外檢測(cè)器（日本島津）；ODS C18柱（大連依利特公司）；KQ3200DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；對(duì)照品：人參皂苷Rg1（批號(hào)110703－200425）、人參皂苷 Re（批號(hào)：110704－200420）、人參皂苷 Rb1（批號(hào)：110704－200420）。對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇（天津四友色譜純）；乙腈（迪馬色譜純）；屈臣氏蒸餾水。肝癥消膠囊（自制，批號(hào)為080806、080810、080815）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（5μm，250mm×4.6mm）；流動(dòng)相為：以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速：1.0mL·min－1；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm。

表1 梯度洗脫程序

2.2 對(duì)照品溶液制備

取對(duì)照品人參皂苷Rg1，人參皂苷Re和人參皂苷Rb1置五氧化二磷干燥器中，減壓干燥48h，取出，精密稱取適量，用甲醇溶解制成每1mL含人參皂苷Rg10.142mg，人參皂苷Re 0.147mg，人參皂苷Rb10.140mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取三批樣品適量，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，取約5.0g，精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，加入甲醇50mL超聲提取30min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)?0mL蒸餾水使溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加乙醚提取2次，每次15mL，棄去乙醚液，水溶液用水飽和的正丁醇提取5次（20mL，20mL，15mL，15mL，15mL），合并正丁醇液，用1%NaOH 洗滌2次（30mL，20mL），棄去堿液，正丁醇液再用正丁醇飽和水洗滌2次，每次20mL，收集正丁醇液，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.4 陰性溶液制備

按處方比例依法配制除人參以外的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液方法制備人參陰性溶液。取以上樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示陰性對(duì)照色譜中，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1峰附近無(wú)其他峰影響。結(jié)果見圖1。

圖1 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的HPLC色譜

2.5 線性關(guān)系的考察

分別精密吸取人參皂苷Rg1對(duì)照品溶液、人參皂苷Re對(duì)照品溶液和人參皂苷 Rb1對(duì)照品溶液2μL、4μL、8μL、16μL、20μL，按上述的HPLC條件分析，以峰面積A對(duì)進(jìn)樣量X（μg）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為：人參皂苷Rg1線性方程為：Y＝24 687.6＋336 161.59X，Y＝0.999 2，線性范圍為：0.284～2.840μg／mL；人參皂苷 Re方程為：Y＝42 006.3＋326 214.661 2X，γ＝0.999 5，線性范圍為：0.294～2.940μg／mL；人參皂苷 Rb1線性方程為：Y＝234 008X－12 141，γ＝0.999 8，線性范圍為：0.280～2.800μg／mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液，于測(cè)定條件下進(jìn)樣10μL，分別重復(fù)進(jìn)樣5次。以3種組分峰面積分別計(jì)算，結(jié)果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb1的RSD分別為：1.30%、0.82%和1.03%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密稱取肝癥消膠囊內(nèi)容物（批號(hào)080806）共5份，按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，取供試品溶液20μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品含量。結(jié)果樣品中測(cè)得人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的平均含量分別為0.186mg／粒、0.093mg／粒和0.179mg／粒，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的RSD分別為2.64%、1.63%和1.47%。測(cè)定結(jié)果表明，本方法重現(xiàn)性符合要求。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取肝癥消膠囊內(nèi)容物（批號(hào)080806），分別按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，分別在0h、0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h進(jìn)樣，結(jié)果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的RSD分別為1.43%、2.71%和1.19%。

2.9 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的肝癥消膠囊樣品6份（批號(hào)080806），分別精密加入人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1對(duì)照品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并在上述色譜條件下測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2、表3。

表2 人參皂苷Rg1和人參皂苷Re加樣回收率試驗(yàn)

表3 人參皂苷Rb1加樣回收率試驗(yàn)

2.10 樣品測(cè)定

取三批肝癥消膠囊內(nèi)容物，分別按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品處理及測(cè)定，結(jié)果見表4、表5。

表4 樣品中人參皂苷Rg1＋人參皂苷Re的含量測(cè)定結(jié)果

表5 樣品中人參皂苷Rb1的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

肝纖維化是慢性肝病的一種組織病理學(xué)診斷，是肝硬化的重要病理基礎(chǔ)，是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)途徑。方中人參、黃芪等中藥具有益氣補(bǔ)血、活血散淤作用，能起到軟堅(jiān)消癥的功效。人參系方中君藥，主要含皂苷類活性成分，因此采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，參照中國(guó)藥典2005版，選定人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1為定量指標(biāo)。本品人參皂苷Rg1和Re總體轉(zhuǎn)移率為50.92%，人參皂苷Rg1轉(zhuǎn)移率為52.94%；故規(guī)定本品每粒含人參以人參皂苷Rg1（C42H72O14）和人參皂苷Re（C48H82O18）的總量計(jì)不得少于0.26mg，人參皂苷 Rb1（C54H92O23）的量計(jì)不得少于0.18mg。通過(guò)三批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得本品每粒含人參皂苷Rg1、人參皂苷Re兩者之和平均含量為0.27mg，人參皂苷Rb1平均含量為0.20mg，可用于肝癥消膠囊的質(zhì)量控制。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典［S］.一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

［2］林曉輝，張雪原.HPLC法測(cè)定心靈丸中人參皂苷Rg1、Re和Rb1的含量［J］.中國(guó)藥師，2009，12（1）：61－63.

［3］杜佳新，顧玉紅，李萌.HPLC測(cè)定益心舒膠囊中人參皂苷Rg1，Re，Rb1的含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（11）：88－90.

［4］苑雅萍，李云濤，郭佳超.HPLC測(cè)定參芪顆粒中人參皂苷Rg1，Re，Rb1的 含 量 ［J］.中 國(guó) 實(shí) 驗(yàn) 方 劑 學(xué) 雜 志，2010，16（16）：74－75.

［5］李宜玲，金光洙.HPLC測(cè)定龜參口服液中人參皂苷 Rg1、Re、Rb1的含量［J］.中藥材，2010，33（5）：881－883.