王 穎, 朱 靖 博, 付 紹 平, 張 凱 璞, 張 毅

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034;2.大連博邁科技發(fā)展有限公司, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

丹參水溶性成分是丹參中的一類(lèi)重要活性成分,具有很強(qiáng)的抗過(guò)氧化和清除自由基的能力[1-2]。丹參水溶性成分多為酚酸性結(jié)構(gòu),常見(jiàn)的有丹參素、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A等[3],其中以丹酚酸B含量最高,但是丹酚酸A對(duì)心肌、腦組織缺血再灌注損傷[4-5]的保護(hù)作用強(qiáng)于丹酚酸B,丹酚酸A還具有良好的抗氧化作用[6],抗肝損傷作用[7]。由于丹酚酸A在丹參中含量極低且性質(zhì)不穩(wěn)定,故采用傳統(tǒng)的提取分離方法難以得到大量丹酚酸A。

丹酚酸B經(jīng)過(guò)水解、脫羧及開(kāi)環(huán)一系列反應(yīng)能夠生成丹酚酸A(圖1)。本實(shí)驗(yàn)以丹酚酸提取物(主要為丹酚酸B)為原料研究了轉(zhuǎn)化制備丹酚酸A的工藝路線,為今后丹酚酸A的工業(yè)化生產(chǎn)和醫(yī)學(xué)研究奠定了的基礎(chǔ)。

圖1 丹酚酸B及丹酚酸A的結(jié)構(gòu)

1 儀器與試劑

Dionex UltiMate3000高效液相色譜儀,美國(guó)戴安公司；1810D型自動(dòng)雙重純水蒸餾器,上海申生科技有限公司；超聲波清洗器,天津奧特塞恩斯儀器有限公司；恒溫電加熱反應(yīng)釜(內(nèi)徑40 mm,最大承壓30 MPa),實(shí)驗(yàn)室自制。

丹酚酸B質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%和28%的丹酚酸提取物,陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司；丹酚酸A、丹酚酸B對(duì)照品,實(shí)驗(yàn)室自制,純度≥98%。實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)自動(dòng)雙重純水蒸餾器處理。

2 試驗(yàn)方法

2.1 酸的配制

精密量取磷酸0.34 mL、硫酸0.27 mL、鹽酸0.42 mL、硝酸0.33 mL,稱(chēng)取檸檬酸1.551 0 g,分別置于5支50 mL容量瓶中,加入去離子水定容至刻度,配置成濃度均為0.1 mol/L的酸溶液。

2.2 丹酚酸A質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱,Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；體積流量,1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng),280 nm；進(jìn)樣量,20 μL；柱溫,25 ℃。流動(dòng)相:A,體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸水；B,乙腈；梯度洗脫條件:0～8 min,8%～18% B；8～15 min,18%～21% B；15～40 min,21%～34% B；40～50 min,34% B。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱(chēng)取丹酚酸A對(duì)照品0.027 5 g于50 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,得到質(zhì)量濃度為0.550 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精確移取1、2、3、4、5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液至5支10 mL容量瓶中,加入甲醇定容,配制成0.055、0.110、0.165、0.220、0.275 mg/mL的不同質(zhì)量濃度梯度的溶液,用于標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。以丹酚酸A的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。求得回歸方程為:Y=638.69X-1.012 6,(R2=0.999 8),丹酚酸A的質(zhì)量濃度在0.055～0.550 mg/mL線性關(guān)系良好。

2.3 轉(zhuǎn)化合成丹酚酸A的方法

精密稱(chēng)取適量丹酚酸提取物(丹酚酸B質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%),加入去離子水超聲溶解,配制成一定濃度的丹酚酸提取物溶液,調(diào)節(jié)pH后,精密吸取5 mL于試管中,密封,將試管置于恒溫電加熱反應(yīng)釜中,在80～120 ℃下加熱1～6 h,加熱完畢后,取出冷卻,將反應(yīng)溶液稀釋至0.5 mg/mL(以反應(yīng)前丹酚酸B計(jì)),經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,進(jìn)樣20 μL進(jìn)行HPLC分析。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出反應(yīng)后丹酚酸A的濃度,據(jù)下式得到丹酚酸A的得率為

YA=CAV/m

式中,YA,丹酚酸A的得率,%；CA,反應(yīng)后稀釋溶液中丹酚酸A的質(zhì)量濃度,mg/mL；V,反應(yīng)后稀釋溶液的體積,mL；m,反應(yīng)前丹酚酸提取物的質(zhì)量,mg。

2.4 酸的種類(lèi)及丹酚酸B含量對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

分別用硫酸、磷酸、鹽酸、硝酸、檸檬酸調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液pH,按照“2.3”的方法進(jìn)行反應(yīng),分別以丹酚酸B質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、28%的丹酚酸提取物和丹酚酸B純品為反應(yīng)原料進(jìn)行反應(yīng),以丹酚酸A的得率為衡量指標(biāo)對(duì)酸的種類(lèi)及丹酚酸B含量進(jìn)行考察。

2.5 轉(zhuǎn)化合成丹酚酸A的單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)

分別對(duì)丹酚酸提取物轉(zhuǎn)化條件中的反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、pH、物料濃度進(jìn)行單因素試驗(yàn),并根據(jù)單因素試驗(yàn)得出的各因素最適范圍,設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn),以確定轉(zhuǎn)化合成丹酚酸A的最佳工藝條件。

3 結(jié)果與討論

3.1 酸的選擇

由圖2及表1可以看出經(jīng)過(guò)高溫高壓反應(yīng)后丹酚酸B的含量明顯下降,而丹酚酸A的含量大幅度增加,在加入不同酸的條件下丹酚酸A的得率均大于3.8%,其中加入硝酸后丹酚酸A的得率最低,加入鹽酸丹酚酸A的得率最高；硫酸、磷酸、檸檬酸三者差距不大,反應(yīng)中丹酚酸A的得率均在4%以上。因此選擇除硝酸外的酸調(diào)節(jié)pH,更有利于丹酚酸A的生成。

圖2 丹酚酸提取物的高效液相色譜圖

表1 酸的種類(lèi)對(duì)轉(zhuǎn)化合成丹酚酸A的影響

3.2 丹酚酸提取物中丹酚酸B的含量對(duì)轉(zhuǎn)化合成丹酚酸A的影響

丹參酚酸B含量對(duì)轉(zhuǎn)化合成丹酚酸A的影響研究表明,丹酚酸B質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%和28%的丹酚酸提取物反應(yīng)后丹酚酸A的得率分別為2.48%和2.34%,而丹酚酸B純品經(jīng)高溫高壓轉(zhuǎn)化后,丹酚酸A的得率僅為0.69%,明顯低于其他兩種原料。由此可以推測(cè),丹酚酸A不完全由丹酚酸B轉(zhuǎn)化而成,可能還與其他酚酸類(lèi)成分有關(guān)。

3.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化合成丹酚酸A的影響

在溫度為120 ℃,pH為4,物料質(zhì)量濃度(以丹酚酸提取物中丹酚酸B計(jì))為5 mg/mL的條件下考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響。由圖3可以看出在1～3 h內(nèi),反應(yīng)溶液中丹酚酸A的得率隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而提高；反應(yīng)時(shí)間為3 h時(shí),丹酚酸A的得率幾乎達(dá)到5%；4 h時(shí)轉(zhuǎn)化丹酚酸A的得率達(dá)到最高；隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),其得率不再有明顯變化。由圖3可見(jiàn),丹酚酸提取物在反應(yīng)4 h時(shí)產(chǎn)生的丹酚酸A最多。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化合成丹酚酸A的影響

3.4 反應(yīng)溫度對(duì)轉(zhuǎn)化合成丹酚酸A影響

在反應(yīng)時(shí)間為4 h,pH為4,物料質(zhì)量濃度(以丹酚酸提取物中丹酚酸B計(jì))為5 mg/mL的條件下考察溫度對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響。由圖4看出轉(zhuǎn)化溫度在80～120 ℃時(shí),丹酚酸A的得率隨著溫度的升高而不斷提高；120 ℃時(shí)丹酚酸A的得率達(dá)到最高；當(dāng)轉(zhuǎn)化溫度達(dá)到140 ℃時(shí),丹酚酸A的得率急劇下降。由圖4可見(jiàn),溫度低于120 ℃時(shí),丹酚酸提取物轉(zhuǎn)化不充分；溫度高于120 ℃時(shí),過(guò)高的溫度和壓力導(dǎo)致轉(zhuǎn)化得到的丹酚酸A遭到破壞,這可能是丹酚酸得率降低的原因。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)轉(zhuǎn)化合成丹酚酸A的影響

3.5 pH對(duì)轉(zhuǎn)化合成丹酚酸A影響

在溫度為120 ℃,反應(yīng)時(shí)間為4 h,物料質(zhì)量濃度(以丹酚酸提取物中丹酚酸B計(jì))為5 mg/mL的條件下考察pH對(duì)反應(yīng)的影響。如圖5所示,pH 1～4,丹酚酸A的得率隨著pH的增大而不斷提高；當(dāng)pH大于4時(shí),丹酚酸A的得率反而降低。由圖5可見(jiàn),反應(yīng)最適pH為4,說(shuō)明反應(yīng)溶液呈酸性時(shí)有利于轉(zhuǎn)化為丹酚酸A,酸性過(guò)強(qiáng)或過(guò)弱都不利于丹酚酸A的產(chǎn)生。

圖5 pH對(duì)轉(zhuǎn)化合成丹酚酸A的影響

3.6 物料質(zhì)量濃度對(duì)轉(zhuǎn)化合成丹酚酸A影響

在溫度為120 ℃,反應(yīng)時(shí)間為4 h,溶液pH為4的反應(yīng)條件下考察物料質(zhì)量濃度(以丹酚酸提取物中丹酚酸B計(jì))對(duì)丹酚酸A得率的影響。如圖6所示,物料質(zhì)量濃度在0.5～5 mg/mL時(shí),丹酚酸A的得率隨著物料濃度的增大而提高；物料質(zhì)量濃度在5～15 mg/mL時(shí),丹酚酸A的得率隨著物料濃度的增大而減小。

圖6 物料質(zhì)量濃度對(duì)轉(zhuǎn)化合成丹酚酸A的影響

3.7 轉(zhuǎn)化合成丹酚酸A的正交試驗(yàn)分析

通過(guò)表2、3可以看出,影響轉(zhuǎn)化生成丹酚酸A的因素主次順序?yàn)锽、A、D、C,即反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、物料質(zhì)量濃度、pH。最佳工藝條件為B2A3D2C3,即反應(yīng)時(shí)間4 h,反應(yīng)溫度120 ℃,pH 5,物料質(zhì)量濃度5 mg/mL。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

4 結(jié) 論

在酸性條件下,經(jīng)高溫高壓處理丹酚酸提取物獲取丹酚酸A是一種可行的制備方法。最佳工藝條件:反應(yīng)時(shí)間4 h,反應(yīng)溫度120 ℃,pH 5,物料質(zhì)量濃度5 mg/mL,其中反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)丹酚酸A的生成影響較大。

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