劉 杰，賈士儒，鐘 成，李 賓，范利花

(工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

檸條葉蛋白堿性提取的響應(yīng)面分析法優(yōu)化

劉 杰，賈士儒，鐘 成，李 賓，范利花

(工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

檸條是一種粗蛋白含量較高的灌木，而且富含全部的人體必需氨基酸．從豐富的檸條資源中提取蛋白對于部分緩解我國目前的蛋白質(zhì)資源緊缺以及環(huán)境保護(hù)等問題具有積極作用；因此，通過 Box-Behnken實驗設(shè)計進(jìn)行檸條葉蛋白堿性提取的響應(yīng)面優(yōu)化，得到了適當(dāng)?shù)哪Ｐ?，并確定了重要參數(shù)的最佳水平．根據(jù)系統(tǒng)給定的參數(shù)得到的預(yù)測值與實測值相當(dāng)接近；檸條葉蛋白提取的最佳工藝條件為：NaOH溶液濃度0.12,mol/L，絮凝pH,2.9，溫度75,℃．最終可得檸條葉蛋白濃縮物相對得率(RLPCY)和蛋白相對得率(RPY)分別為16.2%和41.5%．

檸條；葉蛋白；堿性提??；響應(yīng)面法

Abstract：Caragana microphylla Lam. is shrub with high protein level and all of the essential amino acid. Extracting protein from C. microphylla Lam. offers good alternative to partly eliminate protein shortage and improve environmental concerns in China. Leaf protein alkaline extraction was optimized by Box-Behnken design coupled with response surface methodology，and a regressive model was obtained. The predicted values matched well with the experimental data within the given experimental conditions. The optimal technological parameters were optimized as follow：concentration of NaOH 0.12 mol/L，flocculation of pH 2.9 and flocculation of temperature 75,℃. In optimized condition，the relative leaf protein concentrates yield(RLPCY)and relative protein yield(RPY)of C. microphylla Lam. could reach 16.2% and 41.5% respectively.

Keywords：C. microphylla Lam.；leaf protein；alkaline extraction；response surface methodology

檸條是錦雞兒屬(Caragana Fbar.)植物栽培種的通稱，為典型的歐–亞草原植物地區(qū)落葉灌木，具有萌孽力強(qiáng)、易成林、抗寒、抗旱、耐貧瘠、根系發(fā)達(dá)可固氮等特性，是我國北方干旱、半干旱地區(qū)水土保持、防風(fēng)固沙的先鋒植物[1]．由于檸條具有相對較高的蛋白質(zhì)含量，通常含粗蛋白 14.9%～23.1%(干質(zhì)量)[1]且必需氨基酸含量較為豐富[2]，因此，開發(fā)其作為飼料應(yīng)有較大的實用價值．但是，無論是直接飼用還是微生物發(fā)酵后飼用，其適口性均較差[3–5]，所以，從檸條中提取蛋白質(zhì)作為飼料添加劑，有可能是一條利用檸條的有效途徑．為此，本文根據(jù)檸條等植物蛋白質(zhì)的溶解特性[6]，研究了提取工藝參數(shù)對檸條葉蛋白提取的影響，采用Box-Behnken方法對堿性提取過程進(jìn)行了優(yōu)化，并對回歸模型進(jìn)行了驗證．

1 材料與方法

1.1 材料來源與處理

檸條(小葉錦雞兒，C．microphylla Lam.)，采自內(nèi)蒙古涼城縣，包括枝和葉．自然風(fēng)干后粗蛋白含量為12.9%，水分含量為7.46%．

先將自然風(fēng)干的檸條枝葉采用 FZ102微型植物試樣粉碎機(jī)(河北省黃驊市齊家務(wù)科學(xué)儀器廠)進(jìn)行粉碎，再過 20目標(biāo)準(zhǔn)篩(浙江上虞市華康化驗儀器廠)，然后直接加入水(單因素實驗)或NaOH溶液(優(yōu)化實驗)進(jìn)行浸提，過濾，再采用 pHSJ–4A 型實驗室pH 計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，采用 1.0,mol/L的HCl或0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)濾液pH后進(jìn)行水浴加熱，再以 CR22G型離心機(jī)(日本 Hitachi公司)5,000,r/min離心 10,min，最后干燥得檸條葉蛋白濃縮物[7]．

1.2 蛋白質(zhì)定量方法

檸條粉碎樣品粗蛋白含量采用凱氏定氮法測定[8]．

蛋白提取液蛋白含量以Bradford法[9]進(jìn)行檢測，并以牛血清蛋白(Albumin Fraction V凍干粉，美國Genview公司)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，在722,s型可見分光光度計的595,nm處檢測吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線．

其中，涉及到的相關(guān)計算公式如下：檸條葉蛋白溶出率＝(溶出的蛋白量/檸條樣品中的粗蛋白量)×100%；蛋白沉淀率＝(提取液中沉淀出的蛋白量/提取液中所溶解的蛋白總量)×100%；檸條葉蛋白濃縮物相對得率＝(檸條葉蛋白質(zhì)量/[檸條質(zhì)量×(1–檸條的水分含量)])×100%；蛋白相對得率＝檸條葉蛋白中的蛋白含量/檸條干物質(zhì)粗蛋白含量)×100%．

1.3 單因素實驗與堿性提取的優(yōu)化

單因素實驗中，考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)，浸提時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5,h)，NaOH 溶液濃度(0.00、0.01、0.05、0.10、0.50,mol/L)對檸條葉蛋白溶出的影響；考察絮凝pH(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)，加熱時間(5、10、15、20、25,min)，加熱溫度(50、60、70、80、90,℃)對蛋白沉淀的影響．響應(yīng)面優(yōu)化實驗中，選取了對檸條葉蛋白提取影響相對較大的 3個因素：NaOH溶液濃度、絮凝pH和加熱溫度．

堿性提取的優(yōu)化實驗中，以Box-Behnken實驗設(shè)計研究NaOH溶液濃度、絮凝 pH和絮凝溫度對檸條葉蛋白濃縮物相對得率(RLPCY)和蛋白相對得率(RPY)的影響．每次實驗進(jìn)行3次，每個樣品檢測3次．

1.4 數(shù)據(jù)分析

單因素實驗數(shù)據(jù)采用Origin 8.0進(jìn)行分析，優(yōu)化實驗所得響應(yīng)值均采用Design Expert,7.1.3來研究其顯著性(P＜0.05)，并進(jìn)行方差及回歸分析．

2 結(jié)果與討論

2.1 工藝參數(shù)對檸條葉蛋白溶出和沉淀的影響

考察料液比、浸提時間、NaOH濃度對檸條葉蛋白溶出的影響，結(jié)果如圖 1所示．適宜的條件是料液比為 1∶20，浸提時間為 1,h，NaOH 溶液濃度為0.10,mol/L．

圖1 工藝參數(shù)對檸條葉蛋白溶出的影響Fig.1 Effect of technological parameters on solubilized leaf protein of C. microphylla Lam.

由圖1可以看出，料液比和浸提時間對檸條葉蛋白溶出率的影響相對較小，其最佳條件時的溶出率也不到9%；但對于NaOH溶液來說，則影響顯著，當(dāng)其濃度由0.01,mol/L增加到0.10,mol/L時，檸條葉蛋白的溶出率從總蛋白的14.2%增加到了42.6%；進(jìn)一步增加NaOH溶液濃度到0.50,mol/L時，檸條葉蛋白濃縮物及蛋白相對得率提高得不多．增加 NaOH溶液濃度，有可能在破壞檸條的細(xì)胞結(jié)構(gòu)上起較大的作用，可使細(xì)胞內(nèi)的蛋白溶出，這與Bals等[10]運用 NaOH 溶液從酒糟中提取蛋白質(zhì)的研究結(jié)果相似．但他們最高得到不足總蛋白量30%的蛋白質(zhì)，而本研究可以得到將近50%的總蛋白溶出量，這可能是所用原料本身所含蛋白的不同所致．另外，加入更多的堿達(dá)不到預(yù)期的效果，還會增加后續(xù)的沉淀工序中酸的用量，使成本增加，所以確定NaOH溶液的濃度為0.10,mol/L．

絮凝因素對溶出葉蛋白沉淀的影響如圖 2所示．調(diào)節(jié)蛋白提取液的 pH對檸條葉蛋白沉淀影響大，適宜的絮凝 pH 為 3.0(圖 2(a))．以 70,℃作為絮凝溫度研究加熱時間的影響，發(fā)現(xiàn)其對葉蛋白沉淀影響較小，故此，確定絮凝加熱時間為 5,min即可(圖2(b))．而加熱溫度對葉蛋白沉淀的影響較大，從 50,℃的 88.5%到 90,℃的 97.2%有 9.80%的提高，而當(dāng)溫度為 80,℃時，就已有 95.5%的葉蛋白被沉淀出，故確定絮凝溫度為80,℃(圖2(c))．

圖2 工藝參數(shù)對檸條葉蛋白沉淀的影響Fig.2 Effect of technological parameters on coagulated leaf protein of C. microphylla Lam.

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化檸條葉蛋白的提取

2.2.1 回歸模型的建立

依據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計進(jìn)行實驗，得到如表1所示的相應(yīng)結(jié)果，以Design Expert 7.1.3軟件，得出了各自的回歸方程：

2.2.2 回歸模型的顯著性分析

由模型預(yù)測出RLPCY和RPY值與實測值相關(guān)性較高，其相關(guān)系數(shù)分別為0.92和0.99．

3個影響因素對檸條葉蛋白濃縮物相對得率和葉蛋白相對得率均具有顯著的二次效應(yīng)．其中，NaOH溶液濃度影響顯著，可以通過其顯著線性項(RLPCY和RPY分別為＋2.397,5和＋5.788)和2次項(RLPCY和 RPY分別為－8.1和－24.116,7)來直接描述．

在3個因素間，NaOH溶液的濃度與絮凝pH的交互效應(yīng)最大，NaOH溶液的濃度與絮凝溫度次之，絮凝pH與溫度最小，所以，NaOH溶液的濃度與絮凝pH這兩個因素對于檸條葉蛋白濃縮物及蛋白相對得率影響顯著．

2.2.3 在優(yōu)化的堿性條件下提取蛋白質(zhì)

NaOH溶液濃度對于檸條葉蛋白濃縮物和蛋白相對得率的影響如圖 3所示．使用堿液浸提，得到最大RLPCY和RPY值時具有較適宜的NaOH濃度和絮凝pH．

2.2.4 模型的驗證

根據(jù)以上所得出的優(yōu)化條件進(jìn)行模型的驗證．實驗所得結(jié)果與預(yù)測結(jié)果進(jìn)行比較(表 2)，2個實測值均在 99%的預(yù)測區(qū)間內(nèi)，故所得模型的穩(wěn)定性良好，并能夠反映上述參數(shù)對RLPCY和RPY的影響．

3 結(jié) 論

采用 Box-Behnken實驗設(shè)計，對檸條葉蛋白提取的工藝條件進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化分析，確定其最佳工藝條件為：NaOH溶液濃度0.12,mol/L，絮凝 pH,2.9，加熱溫度 75,℃．此時，檸條葉蛋白濃縮物相對得率為16.2%，蛋白相對得率為41.5%．

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Optimization of Leaf Protein Alkaline Extraction from Caragana microphylla Lam．by Response Surface Methodology

LIU Jie，JIA Shi-ru，ZHONG Cheng，LI Bin，F(xiàn)AN Li-hua
(Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China )

Q946.1

A

1672-6510(2011)01-0001-04

2010-09-03；

2010-11-18

國家科技支撐計劃項目(2007BAK36B05-4)；天津科技大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動基金資助項目(20100413)

劉 杰（1982—），男，湖北潛江人，碩士研究生；通信作者：賈士儒，教授，jiashiru@tust.edu.cn.