黃錠，趙亮，譚文松

華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

犬腎細(xì)胞MDCK無(wú)血清貼壁及單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

黃錠，趙亮，譚文松

華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

近年來，因病毒侵害人類每年都要蒙受巨大的經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)損失。犬腎細(xì)胞MDCK以其具有的培養(yǎng)容易、增殖快、流感病毒感染效率高等特點(diǎn)，成為適用于流感病毒疫苗生產(chǎn)的重要細(xì)胞系之一。以MDCK細(xì)胞為研究對(duì)象，在自制無(wú)血清培養(yǎng)基中成功實(shí)現(xiàn)了MDCK細(xì)胞從有血清培養(yǎng)到無(wú)血清培養(yǎng)的馴化；并通過單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)馴化過程實(shí)現(xiàn)了MDCK細(xì)胞的無(wú)血清單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，獲得了適于無(wú)血清單細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)的ssf-MDCK細(xì)胞株，無(wú)血清單細(xì)胞懸浮批培養(yǎng)最大活細(xì)胞密度可達(dá)3.81×106cells/mL，最大比生長(zhǎng)速率可達(dá)0.056 h?1，分別較有血清貼壁培養(yǎng)提高了3.6和1.6倍。此外，通過比較有血清貼壁培養(yǎng)、無(wú)血清貼壁培養(yǎng)和無(wú)血清單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)三種體系中 MDCK細(xì)胞的生長(zhǎng)和基本代謝情況發(fā)現(xiàn)：無(wú)血清培養(yǎng)過程細(xì)胞生長(zhǎng)快，代謝副產(chǎn)物產(chǎn)率低，尤其是單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方式能獲得較高的細(xì)胞密度，更有利于大規(guī)模生產(chǎn)。該結(jié)果為MDCK細(xì)胞培養(yǎng)過程的優(yōu)化和放大奠定了基礎(chǔ)，也為其他動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程和疫苗等生物制品的工業(yè)化生產(chǎn)提供了借鑒。

MDCK細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基，單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

Abstract:In recent years, there are tremendous economic and social losses across the world because of virus-related diseases.It is well known that Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells are easily handled, quickly amplified and efficiently infected with influenza virus. Therefore, they are considered as one of the most important cell lines for the production of influenza vaccine. In this work, we first developed a serum-free adherent culture process for MDCK cells with an in-house prepared serum-free medium MDCK-SFM. Next, we derived a cell line named ssf-MDCK, which was amenable for single-cell suspension culture in the serum-free medium. We found that during serum-free batch culture of MDCK cells, the peak viable cell density and maximum specific growth rate were 3.81×106cells/mL and 0.056 h?1, respectively; 3.6- and 1.6-fold increase compared with those in serum-containing adherent batch culture. In addition, we compared growth and metabolic characteristics of MDCK cells in serum-containing adherent culture, serum-free adherent culture and serum-free single-cell suspension culture. We found thatless metabolic by-products were produced in both serum-free cultures. In serum-free single-cell suspension batch culture, the viable cell density was highest. These results are critical for establishing large-scale suspension culture of MDCK cells as subsequent well as large-scale influenza vaccine production.

Keywords:Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells, serum-free medium, single-cell suspension culture

MDCK細(xì)胞系由Madin和Darby于1958年從美國(guó) Cocker Spaniel母曲架犬的腎臟組織分離培育建立[1]，通常是以貼壁方式生長(zhǎng)的上皮樣細(xì)胞。目前，MDCK細(xì)胞系廣泛用于多種病毒的擴(kuò)增和純化，如：呼腸孤病毒 (Reovius)、腺病毒 (Adenovirus)、犬細(xì)小病毒 (Canine parvovirus，CPV)、貓粒細(xì)胞缺乏癥病毒 (Feline panleukopenia virus，F(xiàn)PLV) 及禽流感病毒 (Avian influenza virus，AIV) 等[2-5]。由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易變異，MDCK細(xì)胞系被公認(rèn)為最適于甲、乙型流感病毒疫苗生產(chǎn)的3種細(xì)胞系之一[6]。傳統(tǒng)的MDCK細(xì)胞培養(yǎng)大多采用有血清貼壁培養(yǎng)方式[7]。血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種復(fù)雜混合物，其含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需的生長(zhǎng)因子、激素、載體蛋白、貼壁因子、微量元素以及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以有效地促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá)。然而，血清的應(yīng)用也存在許多問題：易受病毒、支原體或其他病原體的污染；批間差異造成產(chǎn)品批次間的質(zhì)量難以嚴(yán)格控制；大量血清蛋白的存在增加了下游分離純化的難度，部分蛋白難以通過分離純化手段徹底去除，影響了產(chǎn)品的最終質(zhì)量；此外，血清來源困難、價(jià)格昂貴，大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用血清將會(huì)大大增加生產(chǎn)成本。

為了克服血清帶來的諸多不利因素，近年來MDCK細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)取得了一些進(jìn)展，幾種適合MDCK細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的商業(yè)無(wú)血清培養(yǎng)基相繼問世[8-13]。如美國(guó)Sigma-Aldrich和Gibco公司分別推出了Ex-Cell MDCK和EpiSerf無(wú)血清培養(yǎng)基。但這些商業(yè)培養(yǎng)基價(jià)格昂貴、配方保密，只適用于部分小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)研究而不適合大規(guī)模生產(chǎn)；不能直接滿足特定細(xì)胞株和生物制品生產(chǎn)的需要，給過程優(yōu)化等研究開發(fā)工作帶來諸多不利，阻礙了其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。因此，開發(fā)可支持MDCK細(xì)胞大量擴(kuò)增的化學(xué)成分明確的無(wú)血清培養(yǎng)基是一項(xiàng)必不可少的基礎(chǔ)工作。

目前，MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)方法基本采用二維單細(xì)胞層貼壁培養(yǎng)。在單細(xì)胞層培養(yǎng)體系中，細(xì)胞增殖易受到基質(zhì)表面積的限制，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，且消化過程亦會(huì)增加工藝的復(fù)雜性、生產(chǎn)時(shí)間和成本。而單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)可以不受細(xì)胞生長(zhǎng)表面的限制，易于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞及產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)。有關(guān)MDCK細(xì)胞培養(yǎng)方式、代謝特征和培養(yǎng)過程的研究工作不多[7]，尤其未見單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方式的相關(guān)報(bào)道。因此，MDCK細(xì)胞無(wú)血清單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)的開發(fā)與研究對(duì)其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程意義重大。

本文以MDCK細(xì)胞為研究對(duì)象，分別在自制適合貼壁和單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基中成功進(jìn)行了無(wú)血清馴化，并通過單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)馴化方法，首次獲得了適合無(wú)血清單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞株。在此基礎(chǔ)上，研究了有血清貼壁、無(wú)血清貼壁和無(wú)血清單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)三種培養(yǎng)體系中MDCK細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝特性，為MDCK細(xì)胞培養(yǎng)、病毒疫苗擴(kuò)增的過程優(yōu)化和放大奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程和疫苗等生物制品的工業(yè)化生產(chǎn)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

犬腎上皮連續(xù)細(xì)胞系 MDCK (Madin-Daby canine kidney cells) 細(xì)胞，購(gòu)自ATCC。

1.2 培養(yǎng)基

有血清培養(yǎng)基：DMEM (GIBCO公司) 補(bǔ)加584 mg/L谷氨酰胺 (Sigma公司)，3 700 mg/L碳酸氫鈉 (Sigma公司)，實(shí)驗(yàn)中根據(jù)需要添加不同濃度的新生牛血清NBS (Newborn bovine serum，GIBCO公司)。

無(wú)血清培養(yǎng)基：在DMEM/F12 (1∶1) 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、膽固醇、碳酸氫鈉、HEPES、Pluronic F68等成分配制而成，經(jīng)Millipore公司0.1 μm微孔濾膜過濾除菌。培養(yǎng)基配制所用的試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)方法

MDCK細(xì)胞方瓶貼壁培養(yǎng)：待細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿方瓶底部80%~90%后，去掉培養(yǎng)基，用無(wú)鈣鎂磷酸緩沖液 (Phosphate buffered saline，PBS) (0.2 mL/cm2)漂洗；室溫下用含 0.25% (W/V) 胰蛋白酶和 0.02%(W/V) EDTA的無(wú)菌消化液 (0.2 mL/cm2) 消化0.5~1 min；倒掉大部分消化液，置于5% CO2濕度培養(yǎng)箱 37 ℃孵育至細(xì)胞收縮變圓，輕搖方瓶至脫落；用預(yù)熱好的培養(yǎng)基稀釋接種到方瓶，接種密度為 1×105~2×105cells/mL。

MDCK細(xì)胞微載體攪拌瓶培養(yǎng)：微載體用PBS洗滌3次，每次洗滌30 min，用移液管吸出PBS后滅菌待用。消化細(xì)胞后，用預(yù)熱好的培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，接種至裝有微載體的無(wú)菌攪拌瓶，接種密度為2×105~3×105cells/mL，微載體用量為 2 mg/mL，培養(yǎng)液體積為200 mL。置于36.8 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，攪拌瓶轉(zhuǎn)速為50 r/min，每攪拌10 min后靜置20 min，如此間歇攪拌1.5 h，之后改為連續(xù)攪拌。

單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)：以2×105~3×105cells/mL的活細(xì)胞密度接種至方瓶或攪拌瓶。方瓶置于轉(zhuǎn)速為50 r/min的搖床上培養(yǎng)，攪拌瓶轉(zhuǎn)速為50 r/min。

1.4 細(xì)胞馴化方法

1.4.1 無(wú)血清馴化方法

逐步適應(yīng)法：第一階段將MDCK細(xì)胞從含10%NBS的 DMEM 培養(yǎng)基轉(zhuǎn)至含 5% NBS的培養(yǎng)基(由含 10% NBS的 DMEM 與無(wú)血清培養(yǎng)基MDCK-SFM按1∶1混合而成)；第二階段將細(xì)胞轉(zhuǎn)至含1% NBS的培養(yǎng)基 (由含10% NBS的DMEM與無(wú)血清培養(yǎng)基 MDCK-SFM按 1∶9混合而成)；第三階段將細(xì)胞消化離心后轉(zhuǎn)入到無(wú)血清培養(yǎng)基MDCK-SFM。

1.4.2 單細(xì)胞懸浮馴化方法

調(diào)整無(wú)血清培養(yǎng)基 MDCK-SFM 中組分及濃度，采用硅化方瓶-搖床體系進(jìn)行單細(xì)胞懸浮馴化。具體方法為：方瓶表面用硅化劑處理，以阻止細(xì)胞貼壁；同時(shí)，調(diào)整培養(yǎng)基組分，使進(jìn)一步優(yōu)化后的培養(yǎng)基可以支持因硅化而未能貼壁的細(xì)胞增殖。先在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng) MDCK細(xì)胞，再將所得的細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移到搖床上培養(yǎng) (50 r/min，不分傳以保證足夠的細(xì)胞數(shù)量)；再將上清中的懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)入硅化過的方瓶中置于搖床上培養(yǎng)，剛開始每2天更換新鮮培養(yǎng)基但不分傳，待細(xì)胞比生長(zhǎng)速率趨于穩(wěn)定后每次傳代前將細(xì)胞密度調(diào)整至適當(dāng)值(約3.0×105cells/mL)，直至細(xì)胞完全失去黏附瓶壁的能力，并能夠以單細(xì)胞懸浮方式穩(wěn)定增殖。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)

以臺(tái)盼藍(lán)染色，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活力?；罴?xì)胞密度=每大格活細(xì)胞平均數(shù)×104；細(xì)胞活性= (活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)) ×100℅。

1.5.2 葡萄糖、乳酸和氨濃度的測(cè)定

葡萄糖濃度采用葡萄糖試劑盒 (購(gòu)自上海科欣生物技術(shù)研究所) 測(cè)定，操作按使用說明書進(jìn)行。

乳酸濃度用乳酸測(cè)定試劑盒 (購(gòu)自南京建成生物工程研究所) 測(cè)定，操作按使用說明書進(jìn)行。

氨濃度采用尿素氮 (BUN) 試劑盒 (購(gòu)自上海申索試劑有限公司) Berthelot比色法測(cè)定。本文直接測(cè)定樣本中氨濃度，故不使用試劑盒提供的脲酶和尿素氮校準(zhǔn)液，改用5 mmol/L NH4Cl作為標(biāo)準(zhǔn)液。其他操作按使用說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 有血清貼壁培養(yǎng)

為了解MDCK細(xì)胞的基本生長(zhǎng)代謝特性，為無(wú)血清培養(yǎng)基的開發(fā)及無(wú)血清馴化奠定基礎(chǔ)，首先考察了有血清培養(yǎng)基 (含 10% NBS的 DMEM) 中貼壁培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況以及葡萄糖、乳酸和氨的基本代謝情況。

圖1為MDCK細(xì)胞在含10% NBS的DMEM培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線。接種后，細(xì)胞經(jīng)約24 h的延滯期，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在50 h時(shí)可以達(dá)到最大比生長(zhǎng)速率，約0.036 h?1，培養(yǎng)至84 h細(xì)胞密度達(dá)到最大值1.07×106cells/mL；之后比生長(zhǎng)速率和細(xì)胞活力迅速降低，至90 h細(xì)胞比生長(zhǎng)速率減少到0 h?1，即進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期；穩(wěn)定期非常短，不到12 h，之后比生長(zhǎng)速率繼續(xù)下降，即進(jìn)入細(xì)胞衰亡期。

圖 2為 MDCK細(xì)胞在有血清貼壁批培養(yǎng)中的葡萄糖、乳酸和氨濃度。由圖可見，細(xì)胞生長(zhǎng)過程中累積消耗 13.87 mmol/L葡萄糖，累積產(chǎn)生乳酸23.42 mmol/L，過程中乳酸對(duì)葡萄糖的得率約為1.69 mmol/mmol，表明約有 84.43%的葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑生成的丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下生成了乳酸；同時(shí)最終整個(gè)培養(yǎng)過程共產(chǎn)生了4.56 mmol/L氨。

2.2 無(wú)血清貼壁培養(yǎng)

2.2.1 無(wú)血清貼壁馴化

圖1 MDCK細(xì)胞有血清貼壁批培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curves of adherent MDCK cells in batch culture with serum containing medium.

圖2 MDCK細(xì)胞有血清貼壁批培養(yǎng)中的葡萄糖、乳酸、氨濃度Fig. 2 Glucose, lactate and ammonia concentration in batch culture of adherent MDCK cells with serum containing medium.

圖3 逐步適應(yīng)法馴化過程中MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)情況Fig. 3 Changes of cell growth during gradual adaptation. (A)Changes of viability and viable cell density. (B) Changes of specific growth rate.

采用逐步適應(yīng)法馴化過程中的細(xì)胞生長(zhǎng)情況如圖3所示。第一階段為第6~14天，細(xì)胞并未出現(xiàn)明顯的不適應(yīng)，最大細(xì)胞密度 Xmax、細(xì)胞活性和細(xì)胞平均比生長(zhǎng)速率略有下降，至第 12天 (即含 5%NBS培養(yǎng)基中培養(yǎng) 6 d) 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)恢復(fù)到初始水平；第二階段為第14~24天，細(xì)胞的平均比生長(zhǎng)速率從 0.51 d?1下降到 0.32 d?1，但之后細(xì)胞狀態(tài)迅速恢復(fù)，傳代4次即恢復(fù)到初始狀態(tài)；第三階段為第 24~32天，細(xì)胞消化離心后直接轉(zhuǎn)到MDCK-SFM中培養(yǎng)，細(xì)胞活性和比生長(zhǎng)速率出現(xiàn)短暫下降，經(jīng)2代培養(yǎng)即可恢復(fù)。經(jīng)26 d馴化后，細(xì)胞狀態(tài)與有血清培養(yǎng)基中相當(dāng)，平均比生長(zhǎng)速率保持在0.52左右，活性維持在95%以上，接種后培養(yǎng)2 d最大活細(xì)胞密度 Xmax可達(dá) 6.95×105cells/mL左右，與含10% NBS的DMEM培養(yǎng)基中 (=0.52 d?1；V=96.45%；Xmax=6.99×105cells/mL) 相當(dāng)，表明已完成細(xì)胞從有血清培養(yǎng)到無(wú)血清培養(yǎng)的馴化過程。

從細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面看，馴化后在無(wú)血清培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)的MDCK細(xì)胞貼壁均勻，細(xì)胞邊緣輪廓不是很明顯，細(xì)胞之間結(jié)合則更加緊密，而無(wú)血清適應(yīng)前在有血清培養(yǎng)基 (含10% NBS的DMEM培養(yǎng)基) 中貼壁生長(zhǎng)的MDCK細(xì)胞輪廓十分清晰，細(xì)胞之間結(jié)合不似無(wú)血清細(xì)胞緊致。馴化前后細(xì)胞形態(tài)對(duì)比如圖4所示。

圖4 MDCK細(xì)胞在無(wú)血清馴化前后貼壁培養(yǎng)形態(tài)對(duì)比Fig. 4 Morphological comparison of adherent MDCK cells in adherent culture before and after serum-free adaptation.

2.2.2 無(wú)血清貼壁批培養(yǎng)

圖5為MDCK-SFM中MDCK貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)情況，由圖可見，在無(wú)血清培養(yǎng)基 MDCK-SFM 中，MDCK細(xì)胞的生長(zhǎng)過程中延滯期較短，僅為12 h左右，此后即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在36 h時(shí)達(dá)最大比生長(zhǎng)速率，約0.035 h?1，至84 h后細(xì)胞密度達(dá)到最大值1.10×106cells/mL；之后比生長(zhǎng)速率迅速降低，至96 h時(shí)減少到0 h?1，即進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期；此后比生長(zhǎng)速率繼續(xù)下降，細(xì)胞進(jìn)入衰亡期。

如圖 6所示，在 MDCK細(xì)胞無(wú)血清貼壁批培養(yǎng)過程中共累積消耗葡萄糖14.33 mmol/L，累積產(chǎn)生15.21 mmol/L乳酸，乳酸對(duì)葡萄糖的得率約為1.06 mmol/mmol，表明約有53.04%的葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑生成的丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下生成了乳酸；同時(shí)，整個(gè)培養(yǎng)過程共生成4.55 mmol/L氨。

圖5 無(wú)血清貼壁批培養(yǎng)中MDCK貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)情況Fig. 5 Growth of adherent MDCK cells in serum-free batch culture.

圖6 MDCK細(xì)胞無(wú)血清貼壁批培養(yǎng)中的葡萄糖、乳酸、氨濃度Fig. 6 Glucose, lactate and ammonia concentration in adherent batch culture of MDCK cell with serum-free medium.

2.3 無(wú)血清單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

2.3.1 無(wú)血清單細(xì)胞懸浮馴化

MDCK細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮馴化過程為：先在適合單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，細(xì)胞部分貼壁，大部分懸浮于上清液中；再將所得細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移到搖床上培養(yǎng) (不分傳以保證足夠的細(xì)胞量，轉(zhuǎn)速為 50 r/min，對(duì)應(yīng)圖 7中2 d處)，懸浮細(xì)胞明顯增殖；再將上清中的懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)入硅化過的方瓶中置搖床上培養(yǎng)，剛開始每2天將細(xì)胞1∶2傳代 (對(duì)應(yīng)圖7中4 d處)，待細(xì)胞比生長(zhǎng)速率趨于穩(wěn)定后每次傳代前將細(xì)胞密度調(diào)整到3.0×105左右，2~3代后細(xì)胞基本失去黏附能力，能夠以單細(xì)胞懸浮方式穩(wěn)定增殖，即單細(xì)胞懸浮馴化成功。

圖7 單細(xì)胞懸浮馴化過程中MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)情況變化Fig. 7 Changes of cell growth during adaptation of MDCK to single-cell suspension cells. (A) Changes of viability and viable cell density. (B) Changes of specific growth rate.

從圖7中可知，在適合單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基中馴化2周左右即可使MDCK細(xì)胞脫離貼壁依賴性，獲得適合單細(xì)胞懸浮方式穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞株。細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后，平均比生長(zhǎng)速率μ可達(dá)0.84 d?1，最大細(xì)胞密度 Xmax維持在 1.60×106cells/mL左右，細(xì)胞活力V可保持在96%以上。馴化得到的細(xì)胞命名為ssf-MDCK細(xì)胞株。

2.3.2 無(wú)血清單細(xì)胞懸浮批培養(yǎng)

本節(jié)考察了 MDCK單細(xì)胞懸浮細(xì)胞株ssf-MDCK在優(yōu)化的無(wú)血清培養(yǎng)基MDCK-SHP中的生長(zhǎng)和基本代謝情況。從圖 8中可以看出，MDCK細(xì)胞單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中基本不出現(xiàn)延滯期，僅前12 h細(xì)胞生長(zhǎng)略顯緩慢，此后即迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在36 h時(shí)可以達(dá)到最大比生長(zhǎng)速率，約0.056 h?1，至72 h細(xì)胞密度達(dá)到最大值3.81×106cells/mL；之后比生長(zhǎng)速率迅速降低，至80 h時(shí)減少到0 h?1，即進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，到此時(shí)細(xì)胞活力始終維持在 96%左右；與貼壁培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞相似，單細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)的MDCK細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)期也不長(zhǎng)，經(jīng)歷不到12 h的穩(wěn)定期后比生長(zhǎng)速率便迅速下降，進(jìn)入衰亡期。

圖8 單細(xì)胞懸浮批培養(yǎng)過程中MDCK生長(zhǎng)情況Fig. 8 Growth of MDCK cells in single-cell suspension batch culture.

ssf-MDCK細(xì)胞單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程的基本代謝情況如圖9所示。批培養(yǎng)過程中累積消耗葡萄糖17.54 mmol/L，累積產(chǎn)生22.98 mmol/L乳酸，乳酸對(duì)葡萄糖的得率約為 1.31 mmol/mmol，表明約有70.75%的葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑生成的丙酮酸在乳MDCK細(xì)胞在接種后能快速適應(yīng)環(huán)境，且生長(zhǎng)速度快；乳酸比生成速率、氨比生成速率和乳酸對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率分別為有血清貼壁培養(yǎng)過程的58.19%、82.80%和 64.81%，這意味著無(wú)血清貼壁培養(yǎng)過程MDCK細(xì)胞產(chǎn)代謝副產(chǎn)物少，有利于培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定，使得過程更易控制，從而有利于細(xì)胞的維持和病毒的擴(kuò)增。

無(wú)血清單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程的延滯期、細(xì)胞倍增時(shí)間和最大比生長(zhǎng)速率分別為有血清貼壁培養(yǎng)的25.00%、63.16%和156.86%，說明無(wú)血清培養(yǎng)過程中培養(yǎng)環(huán)境對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有利，細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，易于在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模；最大活細(xì)胞密度、活細(xì)胞密度對(duì)時(shí)間的積分和細(xì)胞增殖倍數(shù)分別為有血清貼壁培養(yǎng)過程的357.28%、335.06%和200.53%，表明無(wú)血清培養(yǎng)可支持MDCK細(xì)胞高密度生長(zhǎng)；葡萄糖比消耗速率、乳酸比生成速率、氨比生成速率和乳酸對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率分別為有血清貼壁培養(yǎng)過程的38.81%、31.57%、24.19%和81.48%，這意味著無(wú)血清單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中MDCK細(xì)胞耗葡萄糖少，生成代謝副產(chǎn)物較少，有利于支持細(xì)胞更高密度生長(zhǎng)、維持和病毒的擴(kuò)增，同時(shí)能有效緩解規(guī)模放大中的許多問題。酸脫氫酶的作用下生成了乳酸；同時(shí)，整個(gè)培養(yǎng)過程共生成3.42 mmol/L氨。

表1 MDCK細(xì)胞有血清貼壁培養(yǎng)、無(wú)血清貼壁培養(yǎng)和無(wú)血清單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的比較Table 1 Performance comparison among serum-containing adherent culture, serum-free adherent culture and serum-free single-cell suspension culture of MDCK cells

圖 9 MDCK細(xì)胞單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)批培養(yǎng)過程中的葡萄糖、乳酸、氨濃度Fig. 9 Glucose, lactate and ammonia concentration in single-cell suspension batch culture of MDCK cells.

2.3.3 三種培養(yǎng)體系中MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)代謝比較

通過對(duì)MDCK細(xì)胞的有血清貼壁、無(wú)血清貼壁和無(wú)血清單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)3種培養(yǎng)過程中細(xì)胞的生長(zhǎng)和基本代謝情況進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn) (如表1所示)：無(wú)血清貼壁培養(yǎng)過程中MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)的延滯期為有血清貼壁過程的 50%，表明無(wú)血清培養(yǎng)過程

綜上所述，MDCK細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)過程中，細(xì)胞能夠更高效地利用葡萄糖，僅生成少量代謝副產(chǎn)物，能支持較高的細(xì)胞密度和比生長(zhǎng)速率，尤其是無(wú)血清單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中最大細(xì)胞密度和最大比生長(zhǎng)速率分別為有血清貼壁培養(yǎng)過程的 3.6倍和1.6倍。這些結(jié)果對(duì)MDCK細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和病毒擴(kuò)增過程優(yōu)化和放大具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究首先考察了MDCK細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基(含 10% NBS的 DMEM 培養(yǎng)基) 中生長(zhǎng)和代謝特性，在自制無(wú)血清培養(yǎng)基 MDCK-SFM 中成功實(shí)現(xiàn)了MDCK細(xì)胞從有血清培養(yǎng)到無(wú)血清培養(yǎng)的馴化；進(jìn)一步采用硅化方瓶-搖床體系實(shí)現(xiàn)了 MDCK細(xì)胞的無(wú)血清單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，獲得了適合于無(wú)血清單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的ssf-MDCK細(xì)胞。

通過對(duì)有血清貼壁培養(yǎng)、無(wú)血清貼壁培養(yǎng)和無(wú)血清單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)3種培養(yǎng)過程中MDCK細(xì)胞的生長(zhǎng)和基本代謝情況的比較發(fā)現(xiàn)：無(wú)血清貼壁培養(yǎng)過程中細(xì)胞的延滯期明顯較有血清培養(yǎng)過程縮短，細(xì)胞比生長(zhǎng)速率增大，最大活細(xì)胞密度和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞活力與有血清培養(yǎng)過程相近，乳酸、氨的比生成速率及乳酸對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率降低。無(wú)血清單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中細(xì)胞延滯期進(jìn)一步縮短，細(xì)胞生長(zhǎng)速度增快，活細(xì)胞密度和細(xì)胞活力提高，葡萄糖比消耗速率、乳酸和氨的比生成速率都大幅降低，而乳酸對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率有所升高。

綜上所述，無(wú)血清培養(yǎng)過程可以克服血清的引入所帶來的種種問題，尤其是單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方式由于細(xì)胞生長(zhǎng)快、所支持的細(xì)胞密度高、代謝副產(chǎn)物產(chǎn)率低等優(yōu)點(diǎn)使得更易于實(shí)現(xiàn)高密度的培養(yǎng)過程，有利于過程優(yōu)化和放大，具有重要的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)病毒疫苗等制品的生產(chǎn)工業(yè)意義重大。

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Adherent and single-cell suspension culture of Madin-Darby canine kidney cells in serum-free medium

Ding Huang, Liang Zhao, and Wensong Tan
State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China of Science and Technology, Shanghai 200237, China

Received: March 5, 2010; Accepted: May 13, 2010

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 20706016).

Corresponding author: Wensong Tan. Tel: +86-21-64250948; Fax: +86-21-64252250; E-mail: wstan@ecust.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 20706016) 資助。